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[学术文献 ] 北京大学开发PRESENT同义突变筛选方法 进入全文
Nature Biotechnology
2025年6月24号，来自北京大学的魏文胜教授研究团队在《Nature Biotechnology》上发表题为“Prime editor-based high-throughput screening reveals functional synonymous mutations in human cells”的研究论文。该研究利用PEmax系统创建了一个包含297900个工程化Prime编辑向导RNA的文库，并进行了广泛的筛选，以识别影响细胞适应性的同义突变。同义突变通常被认为是中性的，但它们在人类基因组中的作用尚不清楚。与酵母中的近期发现不同，群体水平分析显示同义突变与非同义突变在适应性效应上存在差异，但相对于阴性对照表现出类似的表型分布。经过严格的质量控制后，只有少数突变显示出可测量的效应。对于这些功能性突变，研究者开发了一种专门的机器学习工具，并揭示了它们对信使RNA剪接和转录等各种生物过程的影响，得到了多方面的实验证据支持。研究发现，同义突变可以改变RNA折叠并影响翻译，如PLK1_S2所示。通过将筛选数据与模型整合，研究者预测了具有临床有害性的同义突变。这项研究加深了我们对同义突变的理解，为临床疾病研究提供了见解。研究团队开发了一种名为PRESENT（Prime editor-based screen technology）的同义突变筛选方法，使用PE技术创建了针对3644个人类蛋白编码基因的epegRNA文库，以筛选可能影响人类细胞适应性的功能性同义突变。研究结果证实，尽管人类基因组中的大多数同义突变可能是中性的，但少数可以产生表型变化。通过机器学习，研究者识别了这些突变如何影响一系列生物过程，包括信使RNA剪接、折叠、转录和翻译，并预测了具有临床有害性的同义突变，从而增强了我们对这些突变及其在人类疾病临床研究中的重要性的理解。为了精确且高效地在不同类型的核苷酸替换中产生同义突变，研究团队使用PEmax系统以及epegRNA进行靶向遗传编辑。为了便于高通量筛选，研究者在epegRNA的外部区域整合了条形码，称为eBARs。每个epegRNA都被标记了三个独立的eBARs，有效地为筛选过程创建了三个生物学重复。研究团队选择了人类结肠癌细胞系HCT116作为筛选对象，因为该细胞系由于MLH1基因的自然纯合无义突变而有利于PE编辑。经过一系列特定标准筛选后，研究团队构建了一个epegRNA文库。该文库最初从两个人类疾病数据库ClinVar和SynMICdb中获取潜在的致病性同义突变。此外，研究团队还选择了67个基因进行饱和同义突变设计，这些基因基于它们的突变负荷和表达水平，包括之前在酵母中研究过的人类同源基因。在这组基因中，11个必需人类基因被选为饱和拼接突变设计，以彻底评估同义突变的生物学影响。文库还设计了用于基因敲除的单碱基插入或提前终止密码子的引入，并包含了AAVS1靶向和非靶向epegRNAs作为阴性对照。每个突变位点平均被2.2个epegRNAs靶向。对于11个饱和突变设计的基因，涵盖了点突变范围内的所有可能类型的氨基酸替换。最终，文库包含297900个epegRNAs，针对3644个蛋白编码基因的94993个同义突变和39336个非同义突变。通过慢病毒转导将PEmax稳定整合到HCT116细胞中，并选择单克隆用于后续研究。HCT116-PEmax细胞的表达谱与野生型（WT）细胞几乎相同，且感染了非靶向或AAVS1靶向epegRNAs的HCT116-PEmax细胞作为阴性对照，显示出最小的变化。这表明稳定细胞系与WT HCT116细胞的特性非常相似。研究团队还评估了PEmax在HCT116细胞中的编辑效率。在28天的培养期内，每隔一段时间取样，高效率的FANCF+5 G-to-T突变的编辑在14天后逐渐减缓，而低效率的RNF2+1 C-to-A突变的编辑效率随时间逐渐增加。鉴于表型变化通常滞后于基因型变化，研究团队将筛选时间延长至35天。
[学术文献 ] 加州大学开发蛋白质组学新算法moPepGen 进入全文
Nature Biotechnology
2025年6月16日，加州大学洛杉矶分校的研究团队在《Nature Biotechnology》上发表题为“Identification of non-canonical peptides with moPepGen”的研究论文，介绍了一种名为moPepGen的基于图的算法，该算法能够全面生成非典型肽段，并在多种技术、多个物种以及所有类型的遗传和转录组数据中应用，能够在人类癌症蛋白质组中识别出由生殖系和体细胞基因组变异、非编码开放阅读框、RNA融合和RNA环化产生的以前无法观察到的非典型肽段。蛋白质组学领域的一个挑战是模拟基因表达的复杂性，传统的蛋白质鉴定方法主要依赖于参考数据库，这些数据库通常不包含非典型肽段，而非典型肽段可能来源于基因组变异、转录后修饰、RNA编辑、选择性剪接等过程，尽管近年来蛋白质组学技术取得了进展，但由于计算成本高、假阴性率高以及数据解释和变异鉴定困难，传统的非典型肽段检测策略存在局限性。moPepGen算法通过三个图（转录变体图TVG、肽变体图PVG和肽切割图PCG）来整合变异、进行体外翻译和肽切割，从而系统地遍历每种变异组合，该算法能够处理所有三种阅读框架，以有效捕获移码变异，并促进三框开放阅读框搜索，此外，moPepGen还能够处理替代剪接事件、转录融合和RNA环化等复杂情况。研究团队通过一系列实验验证了moPepGen的准确性和效率，首先使用1,000,000次模糊测试迭代来验证moPepGen，将其生成的非典型肽段与基于穷举法的算法进行比较，结果显示moPepGen具有完美的准确性和线性运行时间复杂度，其次将moPepGen与其他两种流行的自定义数据库生成器进行比较，发现moPepGen在预测包含多种变异类型的肽段方面更为敏感，并且能够检测到其他方法无法检测到的肽段，在人类癌症细胞系的蛋白质组中，moPepGen能够从376个细胞系中生成包含体细胞单核苷酸变异、小插入和缺失以及转录融合的非典型肽段数据库，在匹配的蛋白质组数据中，moPepGen能够检测到更多的非典型肽段，这些肽段主要来源于非编码转录本的开放阅读框，此外，moPepGen还能够检测到由RNA编辑、转录融合和选择性剪接产生的变异肽段。moPepGen是一种计算效率高的算法，能够在任意变异类型下枚举转录组和蛋白质组的多样性，能够跨物种、蛋白酶和技术检测变异和新开放阅读框肽段，可以整合到现有的蛋白质分析工作流程中，并广泛增强许多应用中的蛋白质组学分析，研究团队展示了moPepGen在多个领域的应用，包括在人类癌症细胞系中检测体细胞变异产生的非典型肽段，在小鼠C57BL/6N品系中检测生殖系变异产生的非典型肽段，在人类前列腺癌样本中检测由多种基因表达调控层产生的非典型肽段，包括生殖系单核苷酸多态性、选择性剪接事件和circRNA回剪接，在数据独立采集（DIA）质谱中检测非典型肽段，这些应用实例证明了moPepGen在蛋白质组学研究中的广泛适用性和强大的功能，为未来的蛋白质组学研究提供了一个强大的工具。
[学术文献 ] 南京农业大学揭示光信号调控水稻抽穗期的新机制 进入全文
Nature Communications
2025年6月19日，南京农业大学进一步研究发现，ELD1可与光敏色素phyB的活性形式互作，参与红光调控OsCCA1剪接的过程，揭示了光信号通过可变剪接调控生物钟的分子机制。该研究克隆到一个在长日照条件下特异性调控水稻抽穗的基因Early Flowering at Long Day 1 (ELD1)。该基因编码呈核散斑定位的CCHC-type锌指蛋白，其功能完全缺失会胚胎致死，但特定氨基酸点突变可显著促进抽穗而没有明显的农艺性状缺陷。研究发现，ELD1可与OsNKAP（哺乳动物NF-κB activating protein同源物）及多个核心mRNA剪接因子互作。全长转录组测序分析发现，ELD1在全基因组范围内调控上千个基因的可变剪接，特别是在生物钟核心基因 OsCCA1 上介导多个位点的剪接事件。分子与遗传分析表明，ELD1主要通过 OsCCA1-Hd1通路影响水稻抽穗期。进一步研究发现，ELD1可与光敏色素phyB的活性形式互作，参与红光调控OsCCA1剪接的过程，揭示了光信号通过可变剪接调控生物钟的分子机制。值得一提的是，长读长测序显示OsCCA1具有超过60种剪接异构体，其功能差异和动态调控机制仍有待深入研究。综上，该研究不仅揭示了光信号调控水稻抽穗期的全新机制，且在分子育种上取得突破。利用碱基编辑技术对ELD1关键氨基酸进行定点突变，在宁粳7号、宁粳4号等优良品种背景下成功培育出早抽穗新种质，为植物发育必需基因在育种中的应用提供了新范式。
[学术文献 ] 加州大学揭示RNase MRP快速耗竭诱导细胞可逆性增殖停滞的新机制 进入全文
Nature Communications
2025年6月18日，来自加州大学河滨分校的通讯作者 Jernej Murn 研究团队在《Nature Communications》期刊发表题为《Reversible proliferative arrest induced by rapid depletion of RNase MRP》的研究论文，该研究发现快速耗竭深深保守的RNA酶MRP（RNase MRP）可诱导人类细胞发生长期且可逆的增殖停滞。RNase MRP是一种RNA基础的酶，对于rRNA的生物合成至关重要。研究显示，在RNase MRP被快速耗竭的情况下，细胞的rRNA生物合成受到严重损害，同时伴随着急性转录重编程，这些变化先于细胞关键功能的逐步下降。许多进入增殖停滞的细胞显示出组蛋白mRNA水平上升，这些mRNA在细胞质中局部积累，S期DNA含量增加。细胞可以从周期的多个阶段进入这种增殖停滞状态，并且可以持续数周而细胞活性不受影响。值得注意的是，恢复RNase MRP的表达可以完全逆转停滞状态，细胞增殖以与对照细胞相同的速度重新启动。研究提出，靶向rRNA生物合成可能是一种快速诱导可逆增殖停滞的通用策略，这对于理解和操纵细胞静止具有重要意义。研究还发现，组蛋白mRNA在增殖停滞的细胞中积累，这可能与翻译抑制有关，尤其是在那些在S期停滞的细胞中。此外，研究团队通过RNA测序和转录组分析，发现RNase MRP的耗竭触发了广泛的基因表达变化，包括与翻译、tRNA处理和组蛋白mRNA相关的基因的显著诱导。这些发现不仅加深了我们对细胞如何在压力下进入静止状态的理解，还为开发新的细胞静止操纵策略提供了潜在的靶点，这可能对癌症治疗和再生医学等领域产生影响。
[学术文献 ] 哈佛医学院揭示USP37防止复制体过早解体中机制 进入全文
Nature Communications
2025年6月18日，来自哈佛医学院Johannes C. Walter和Stephen P. Jackson研究团队在《Nature Communications》期刊发表题为《USP37 prevents premature disassembly of stressed replisomes by TRAIP》的研究论文。该研究深入探讨了去泛素化酶USP37在维持基因组稳定性中的关键作用，特别是在防止复制体在复制压力下过早解体的过程中的功能。真核生物的复制体在DNA复制过程中常会遇到蛋白障碍，这些障碍可能威胁基因组的完整性。E3泛素化酶TRAIP负责移除这些障碍，但必须被精确调控，以避免不适当的泛素化和复制体解体。研究发现，人类细胞中缺乏去泛素化酶USP37会导致对拓扑异构酶毒物和其他复制压力诱导剂的超敏感性。进一步的实验表明，当TRAIP缺失时，USP37敲除细胞对拓扑异构酶抑制剂的超敏感性得以恢复。研究团队通过CRISPR-Cas9基因编辑技术对人类细胞进行基因敲除实验，并利用Xenopus egg extracts模拟细胞环境，观察到在USP37耗尽的情况下，TRAIP会促进CMG的过早泛素化和解体，尤其是在复制体因压力停滞时。研究还发现USP37通过与CMG解旋酶的CDC45亚基结合来响应拓扑压力，并通过AlphaFold-Multimer的结构预测分析支持了这一发现。该研究不仅增进了对DNA复制和基因组稳定性维持机制的理解，还为癌症治疗提供了潜在的新靶点。由于USP37的催化活性对保护细胞免受拓扑异构酶抑制剂和复制压力诱导剂的毒性至关重要，因此USP37抑制剂可能对表现出复制压力升高的癌细胞具有选择性毒性。此外，抑制USP37可能改善因TRAIP突变导致的小头畸形性侏儒症相关表型。研究团队总结道，USP37在防止复制体过早解体中发挥着至关重要的作用，其通过抑制TRAIP的活性，使复制体能够在压力下继续完成DNA复制，而USP37的缺失会导致TRAIP的过度活性，从而引起DNA损伤和细胞死亡。这一发现为开发新型癌症治疗方法提供了理论基础，并可能对相关遗传疾病的治疗提供新的思路
[学术文献 ] 中国农大通过共转移免疫受体实现跨物种抗病 进入全文
Cell
2025年6月17日，中国农业大学植物保护学院郭海龙教授团队在Cell在线发表题为Interfamily co-transfer of sensor and helper NLRs extends immune receptor functionality between angiosperms的研究论文，首次系统证明通过共转移感受型与辅助型NLR免疫受体，可打破NLR免疫受体的“受限的分类学功能”瓶颈，在分类学跨度较大的植物间重建免疫信号通路。这一突破性发现不仅为作物病害的绿色防控提供了可行的新策略，也为未来多物种间的分子设计育种提供了重要理论依据和实践示范。植物胞内核苷酸结合结构域和富含亮氨酸重复序列受体蛋白 (Nucleotide-binding domain, Leucine-rich repeat containing Receptors, NLRs) 通过直接或者间接的方式识别病原微生物分泌的效应蛋白激活效应子引发的免疫 (Effector-Triggered Immunity, ETI)，引发细胞坏死进而抵御病原菌的侵染。目前克隆的抗病基因大都编码这类免疫受体蛋白，因此NLRs是抗病育种的重要靶蛋白。NLRs 作为在植物体内快速进化的一类蛋白，表现出一定的植物种属（科属）特异性；而一些效应蛋白广泛分布于同属（种）病原菌乃至不同病原菌中，因此在物种间转移NLR免疫受体是构建作物抗病性的一种潜在策略，如科学家们早期将来源于烟草的N基因转移至番茄，赋予了对烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus, TMV）的抗性。将来源于拟南芥的抗白锈病免疫受体WRR4引入至芥菜（Brassica juncea）和欧洲油菜（Brassica napus）赋予了对白锈病菌（Albugocandida）的抗性。将小麦Sr22和Sr33等秆锈病抗病基因转入大麦可赋予对大麦抗秆锈病的能力。纵观目前NLRs的跨界转移赋予抗病性的例子大都发生在彼此亲缘关系较近的科内（intrafamily）物种间，而很多NLRs跨科（interfamily）转入远缘物种后常出现抗病功能丧失，造成跨物种转移应用中受限的分类学功能（Restricted Taxonomic Functionality, RTF），例如由野油菜黄单胞菌辣椒斑点病致病变种（X. campestris pv. vesicatoria, Xcv）引起的辣椒和番茄细菌性疮痂病是普遍发生在茄科植物上的一种细菌性病害，将源于辣椒的抗Xcv的NLR基因Bs2转移至番茄中，转基因番茄表现出对Xcv良好的抗性，这种基因对基因抗性依赖于效应蛋白AvrBs2。但将Bs2转移至亲缘关系较远的拟南芥和木薯中，转基因拟南芥和木薯并未表现出对野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(X. campestrispv. campestris, Xcc）和地毯草黄单胞菌木薯萎蔫致病变种(X. axonopodispv.manihotis)的抗性，尽管效应蛋白AvrBs2的在Xcc和Xam中也高度保守。这与细胞质膜上的模式识别受体 (Pattern Recognition Receptors, PRRs) 的跨界转移不同，比如拟南芥模式识别受体EFR虽然只分布在十字花科植物中，但在番茄、水稻、小麦乃至柑橘、香蕉等果树中表达EFR也能赋予这些植物识别细菌延伸因子EF-Tu的能力并增强它们的细菌抗病性，这与PRRs下游信号通路在不同物种中相对保守有关。因此RTF很大程度上限制了NLRs在远缘作物中开展抗病种质创制的应用。水稻细菌性条斑病是由稻生黄单胞菌条斑致病变种(X. oryzaepv.oryzicola, Xoc) 通过伤口或气孔侵入导致，是我国重要的水稻病害之一，每年造成巨大的水稻产量损失。但在水稻种质资源中至今尚未鉴定到编码NLR受体的主效抗病基因，严重制约了对这类病害的防控效果。研究团队基于AvrBs2在黄单胞菌属中高度保守这一现象，发现在烟草中瞬时表达Bs2和Xoc的AvrBs2能诱发细胞坏死，表明Bs2能识别直系同源效应蛋白AvrBs2Xoc，这为在远缘物种水稻中利用辣椒的Bs2防治细菌性条斑病提供了基础，但Bs2转基因水稻并没有赋予对Xoc的抗病性，这与前期发现的Bs2在木薯和拟南芥中呈现出RTF的现象是一致的。近年来研究发现在激活细胞死亡和抗病反应过程中，一类称为辅助型NLRs （Helper NLRs）位于识别病原菌无毒蛋白的感受型NLRs（Sensor NLRs）下游，辅助型NLRs对于感受型NLRs激活后的抗病信号的传递起到关键作用，如拟南芥ADR和NRG1家族以及茄科特有的NRC家族。鉴于前期研究表明Bs2的功能需要依赖这类辅助型NRCs，推测NRCs类辅助型NLRs在其它远缘作物中的缺失是Bs2应用存在RTF的关键原因。鉴于水稻与辣椒分化于大约2亿年前，仅共转移Bs2和NRCs是否就足以在水稻中重构ETI信号通路还是需要额外的茄科特异的蛋白还不清楚。研究团队将辣椒Bs2及烟草NRC2/NRC3/NRC4辅助型免疫受体共同转移至水稻中，接种Xoc而非ΔAvrBs2突变菌株能诱导NRC2和NRC4在转基因水稻里寡聚化，表明在水稻里重构AvrBs2Xoc激活Bs2的ETI信号通路，暗示仅转移茄科植物的感受型和辅助型NLR受体就足以在水稻中重构ETI信号通路。接种Xoc后发现转基因水稻表现出对水稻细菌性条斑病菌的ETI抗病性，而共表达感受型和辅助型NLR免疫受体的转基因水稻重要农艺性状如株高、有效分蘖数、每穗粒数、千粒重无明显差异；转基因水稻的基础抗性也不受影响。此外，英国赛恩斯伯里实验室 (The Sainsbury Laboratory) 的Jonathan Jones研究团队也发现转基因拟南芥共表达源于光果龙葵 (Solanum americanum) 晚疫病抗病基因Rpi-amr3和光果龙葵或烟草的NRC2在用细菌投递致病疫霉 (Phytophthora infestans) 效应蛋白AvrAmr3后能诱发细胞坏死，共表达Bs2及Rpi-amr1和光果龙葵的NRC2/NRC3/NRC4在大豆中可以引起AvrBs2及AvrAmr1诱发的细胞坏死，表明通过共转移辅助型NLR可将感受型NLR受体的功能拓展到其它多个植物中。该成果克服了Bs2这类免疫受体跨远缘物种利用障碍这长期悬而未决的难题，在国际上首次阐明共转移感受型和辅助型NLR受体可以打破NLR的RTF，实现NLR受体在不同作物中抗病育种的广泛应用。基于此策略，在水稻里重建针对细菌性条斑病菌的免疫通路创制了对细菌性条斑病菌抗病性的水稻新种质资源。这为在种质资源中缺乏内源抗病基因，利用其它物种NLRs的生物育种应用提供了很好的范例。例如一些致病疫霉的效应蛋白在其它疫霉菌种中是保守的，一些早期克隆的能识别致病疫霉效应蛋白的茄属NLRs也能够识别其它疫霉菌中的直系同源效应蛋白。如果将这些茄属NLRs与NRCs共同转移至大豆、可可和草莓等作物也能提供对侵染这些作物疫霉菌的抗性。因此该研究为病害绿色防控和生物育种提供了重要理论基础和育种策略。
