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[学术文献 ] 韩国全北国立大学在生菜中开发基于RNA的高效腺嘌呤和胞嘧啶碱基编辑器 进入全文
JIPB
2024年12月18日，韩国全北国立大学Beum‐Chang Kang课题组在JIPB发表题为“DNA‐free base editing in lettuce via in vitro transcribed base editors”的短文。研究团队开发了两种基于RNA的碱基编辑系统，在不引入外源DNA的情况下，实现了对生菜高效、精准的基因编辑。研究人员开发了T7启动子驱动的腺嘌呤碱基编辑器 (ABE；TadA8e-nCas9(D10A)) 或胞嘧啶碱基编辑器 (CBE；hA3A-nCas9(D10A)-UGI)，并使用体外技术合成目标基因的sgRNAs，通过PEG介导的转染方法，将碱基编辑器RNA (ABE或CBE的mRNA和sgRNA) 转入生菜原生质体，通过靶向深度测序分析在原生质体、愈伤组织、芽体和植物中的编辑效率。团队首先以生菜开花基因LsFT为靶基因，检测了无DNA的ABE系统的编辑效率。ABE‐sgRNA在LsFT基因中诱导了腺嘌呤到鸟嘌呤的转换，在生菜原生质体中的编辑效率高达6.24%。在愈伤组织中，这一转换的频率在0.65%到37.6%之间，而在芽体中则为0.50%到50.0%。在长日照条件下，ABE‐sgRNA碱基编辑的生菜相较于对照组表现出晚花表型，表明编辑在再生过程中得到了保持。接下来，团队检测了CBE对靶基因生菜乙酰乳酸合成酶 (LsALS) 的编辑。LsALS是分支链氨基酸生物合成中的关键酶，其氨基酸突变 (P184F) 导致磺酰脲类 (SU) 除草剂抗性 (Zhang et al., 2019)。靶向深度测序结果显示，CBE‐sgRNA在生菜原生质体以高达12.6%的效率诱导了胞嘧啶到胸腺嘧啶的转换。对照组的愈伤组织在除草剂处理后死亡，而CBE‐sgRNA处理组保持绿色并生成芽体，表明CBE通过编辑靶基因赋予植物除草剂抗性。综上，该研究建立了一个有效的基于RNA的腺嘌呤和胞嘧啶碱基编辑系统，在生菜的育种中发挥重要作用。该系统提供了一种安全、精确且高效的基因组编辑策略，在提高作物抗性和改良性状方面具有广泛的应用前景。
[学术文献 ] 中科院揭示裸子植物核型演化历史和关键模式 进入全文
Advanced Science
2024年12月25日，中国科学院昆明植物研究所马永鹏研究员与孙卫邦研究员联合中国科学院植物研究所汪小全研究员、瑞典于默奥大学研究团队，在Advanced Science发表题为Convergent Patterns of Karyotype Evolution UnderlyingKaryotype Uniformity in Conifers研究论文，研究团队通过比较基因组分析，重建了裸子植物核型演化历史，揭示了松柏类核型演化的关键模式，为裸子植物的物种多样性演化与保护提供了新的视角。研究团队通过对16种裸子植物染色体水平的基因组共线性分析，发现松科、柏科、红豆杉科、银杏、苏铁基因组间都显示出一对一的共线性，表明这些物种都未曾经历过谱系特有的古多倍化事件，进而排除了古多倍化对裸子植物主要分支（买麻藤类除外）核型的影响。共线性模式进一步表明松柏类基因组间发生了频繁的非同源染色体之间的相互易位(reciprocal translocations, RTs)，这些易位以染色体臂为单位，其断点通常都位于着丝粒附近，故命名为着丝粒–着丝粒相互易位(centromeric–centromeric reciprocal translocations, CRTs)。此外，研究人员在柏目基因组中发现了另一种相互易位，其断点分别位于一条染色体的着丝粒附近和另一条染色体的端粒附近，因此命名为端粒–着丝粒相互易位(telomeric–centromeric reciprocal translocations, TRTs)。进一步的研究确认，CRTs是松柏类核型演化的最主要模式，而TRTs则在柏目植物中的递减异倍化(descending dysploidy)中发挥了关键作用。由于CRTs反复频繁发生，解析裸子植物核型演化路径面临巨大挑战。研究团队用图论的方法(graph-based method)简化了CRTs的发生路径，并进一步重建了裸子植物从共同祖先核型(proto-gymnosperm karyotype,PGK；n = 12)到现代核型(n = 11–12)的详细演化路径。重建结果显示：松科中，先发生了5次共有CRTs，之后油松中发生了一次特有CRT（chr1和chr3之间），而巧家五针松中也发生一次特有CRT（chr5和chr11之间）；这些CRTs导致了7条染色体的重新组合，而剩余5条染色体则保持了祖先状态。在柏目中情况更为复杂，几乎所有的染色体相对于PGK都发生了重新组合，模拟分析表明CRTs很可能已经饱和，因此无法推断部分分支内CRTs发生的确切次数。此外，推断柏目共同经历一次TRT事件，产生了一条只有一个祖先染色体臂的端着丝粒染色体，之后在不同分支中经历了不同的演化路径。在柏科中，这条染色体的短臂（仅端粒）通过至少5次CRTs传递给了PGK-6S（PGK 6号染色体短臂），之后又通过一次TRT，PGK-6S的着丝粒端与PGK-5S的端粒端发生融合；形成的副产物可能是一条极短的染色体，并最终丢失，导致柏科祖先染色体数目降低到n = 11。类似的递降异倍化也独立发生于香榧基因组（n = 11）中。在红豆杉（n = 12）中，这条端着丝粒染色体虽然也经历了一次CRT，但依旧存在至今。总之，在柏目中，先是一次TRT改变了染色体结构和形态，之后不同谱系（柏科和香榧）独立发生的TRTs又降低了染色体数目。研究人员还讨论了CRTs和TRTs可能的发生机制和潜在影响。CRTs频繁发生于着丝粒区域，可能是因为松柏类中普遍存在的拉布尔构型(Rabl configuration)将着丝粒聚集在一起，促进了着丝粒间的相互作用和易位。着丝粒区域大量的重复序列也能够促进非等位同源重组(non-allelic homologous recombination, NAHR)介导的相互易位。值得注意的是，反复发生的CRTs可能发生在同一着丝粒区域的不同位置。而TRTs可能偶然发生于减数分裂时期，端粒花束结构(telomere bouquet)的形成可能促进了端粒–着丝粒的互作和易位。当TRT的产物中有一条极短的染色体时，这条染色体因为不含有必需基因而可能丢失，导致递降异倍性。这与被子植物中的染色体末端融合(end-to-end fusion)类似，但被子植物异倍性的发生机制十分多样，并不局限于这种类似于TRT的机制。裸子植物超长的染色体可能限制了其他机制的发生。另外，CRTs和TRTs能够产生不同的核型、引起生殖隔离，可能促进了裸子植物的物种形成和多样化。该研究不仅加深了我们对裸子植物核型演化的认识，而且对植物染色体演化研究具有重要参考价值。
[学术文献 ] 中国农大同时编辑两个基因在T0获得非转基因的纯合编辑植株 进入全文
Plant Communications
2024年12月20日，中国农业大学植物保护学院姜临建副教授与生物学院陈其军教授团队合作，在Plant Communications在线发表了题为“One-step generation of prime-edited transgene-free rice”的文章。该研究通过同时编辑两个基因（一个作为筛选标记，一个作为目标基因），直接在T0代获得了非转基因的纯合编辑植株。本研究中，研究人员首先利用引导编辑技术精准编辑OsALS-W548M来获得对啶磺草胺除草剂的抗性。因此，在愈伤组织的筛选过程中，使用仅含有啶磺草胺的培养基来筛选抗性愈伤并进行再生，成功地在T0代得到了非转基因且OsALS-W548M纯合编辑植株。随后，研究人员利用Csy4和新的逆转录酶变体进一步优化了编辑系统。在此基础上，研究人员构建了以OsALS-W548M为筛选标记，并分别对OsEPSPS、OsXa5、OsCold1进行引导编辑的三个共编辑载体。结果表明，在啶磺草胺的筛选下，均成功地在T0代鉴定到非转基因纯合编辑植株，效率分别为46%、36%和41%，同时未发现脱靶现象。这一研究成果为作物的快速改良开辟了新路径，同时为引导编辑技术在多年生及无性繁殖作物中的应用及优化提供了新的思路。
[学术文献 ] 明尼苏达大学优化FoMV载体递送sgRNA实现快速编辑高粱基因组 进入全文
The Plant Journal
2024年12月11日，明尼苏达大学Daniel F. Voytas教授团队在The Plant Journal上发表了一篇题为“Rapid and efficient in plantagenome editing in sorghum using foxtail mosaic virus-mediated sgRNA delivery”的研究论文。该研究优化的狐尾花花叶病毒 (FoMV)载体能够直接感染高粱并在全株范围内传播，绕过了组织培养的过程，成功递送sgRNA至体细胞并诱导高频率的基因突变 (突变率最高达60%)，且产生了明显的表型变化。研究致力于提升病毒载体效率，评估狐尾花叶病毒 (FoMV) 和大麦条纹花叶病毒 (BSMV)在递送高粱基因组编辑所需荧光蛋白AmCyan和sgRNA方面的有效性。FoMV载体利用重复的衣壳蛋白启动子（dpCP）驱动来表达荧光蛋白AmCyan或sgRNA， BSMV则是通过在其γb基因组下游插入AmCyan或sgRNA (并在γb终止密码子后附加短连接序列，无需额外添加启动子序列) 来实现表达。所有FoMV和BSMV的病毒T-DNA均被设计为在35S启动子的调控下进行转录，荧光蛋白AmCyan和sgRNA的插入位点被视作病毒货物(Cargo) 。通过农杆菌侵染野生型本氏烟草叶片，成功从两种病毒基因组表达荧光蛋白AmCyan。七天后，在侵染的烟草叶片中检测到AmCyan的荧光信号，并制备病毒液以供进一步使用。用两种病毒液摩擦接种2周龄野生型BTx430高粱植株，结果显示：感染FoMV-AmCyan的高粱系统叶呈现强烈的绿色荧光，表明病毒成功感染和移动，而接种BSMV-AmCyan病毒汁液的高粱植株以及野生型对照叶均未检测到荧光。接种后，高粱系统叶中AmCyan信号初期微弱，后期增强，表明FoMV感染强烈。Western blot分析确认FoMV和BSMV病毒基因组均能表达AmCyan蛋白，但BSMV无法感染高粱，这些结果展示了AmCyan蛋白在两种病毒系统中的有效表达，适用于基于荧光的病毒感染和移动追踪应用。为了探索在高粱中使用FoMV介导的基因组编辑的可行性，将针对MgCh、Lw1、PDS基因 (这些酶的破坏会影响植物生产类胡萝卜素和叶绿素的能力) 的sgRNA序列整合到FoMV病毒基因组中。用携带FoMV构建的农杆菌接种本氏烟草植物以产生病毒液，再将病毒液接种到2周龄稳定过表达Cas9-GFP的转基因高粱植株的叶片上，实现了高粱中特定位点的基因组编辑，导致叶绿素生物合成受损和类胡萝卜素途径基因表达改变等表型变化。为了评估FoMV介导的高粱基因组编辑效率，在感染后45天从每株植物的第4、5、6片系统叶中采集了组织样本并进行PCR扩增和Sanger测序。结果表明在MgCh和Lw1目标区域，至少在三株独立植物中观察到了体细胞编辑，单株植物的突变效率最高达53%，所有FoMV-sgMgCh感染植物的平均突变率为40%，FoMV-sgLw1感染植物中编辑的体细胞最高比例为38%，平均突变率为30%。序列分析显示，突变主要为PAM上游3bp处的小缺失。相比之下，PDS目标区域的编辑仅在一株植物中检测到，且染色体1和6上的重复基因突变频率分别为20%和35%，大多数感染植物未能存活，推测可能与siRNA介导的基因沉默有关。通过摩擦接种实验发现，除导致致死表型的PDS靶向sgRNA外，其他sgRNA均可高效诱导高粱体细胞基因编辑。为进一步评估直接农杆菌接种方法的效率，使用替换PDS靶向sgRNA为GFP靶向sgRNA的FoMV构建体，并利用已知能将T-DNA转移到单子叶植物中的农杆菌GV3101菌株，将这些病毒载体传递到过表达Cas9-GFP的高粱幼苗中。在注射后5天，系统叶中观察到MgCh、Lw1和GFP的编辑，15天内出现特定于每种突变的表型。证明了直接农杆菌接种方法在高粱基因组编辑中的潜力，且该方法更高效，无需使用本氏烟草感染和病毒汁液制备。本研究证明了FoMV介导的高粱体内基因编辑，并强调了通过改进此方法为生成具有靶向修饰的后代植物提供机遇，无需组织培养或重复转化。但在本研究，由于病毒载体的运载能力，巨大的Cas9蛋白需要通过传统遗传转化方法提前转化进受体体内，这一步仍然是巨大的限制。如果能进一步改进FoMV病毒载体则有望培育无转基因高粱，实现可遗传基因编辑，这将极大推动高粱育种及开发优质品种。实现可遗传基因编辑将是一项重大突破，使高粱能够在世代间实现精确稳定的遗传改良。
[学术文献 ] 扬州大学开发基于植物基因组的基础DNA大语言模型 进入全文
Molecular Plant
2024年12月9日，扬州大学农学院张韬教授课题组在Molecular Plant在线发表了题为PDLLMs: A group of tailored DNA large language models for analyzing plant genomes的研究论文，开发了一系列基于植物基因组的基础DNA大语言模型，该研究构建的130M大小的plant DNAMamba模型仅以十分之一的参数量就打败了由InstaDeep、Google DeepMind顶尖机构联合开发的同类模型AgroNT。模型的开发填补了植物基因组研究中缺乏适宜本地化运行的基础DNA大语言模型的空白。在该研究中，作者首先基于14个代表性的植物参考基因组，结合5种先进的基础架构设计，包括BERT, NT, GPT, Gemma和Mamba，构建了一系列大小在100M左右且适用于植物的基础DNA大语言模型。之后作者构建了一套植物基因组预测数据集，包含核心启动子、序列保守性、多种组蛋白修饰、lncRNAs、开放染色质和启动子活性的预测任务。将先前构建的不同DNA大语言模型应用到这些预测任务中，并与3个代表性DNA大语言模型（DNABERT-2、NTv2和AgroNT）进行比较，结果表明该研究构建的大语言模型整体上优于其他非植物的DNA大语言模型。除此之外，基于Mamba的植物DNA大语言模型几乎在所有预测任务中均强于比其参数量多10倍的植物基础模型AgroNT。说明基于新架构的DNA模型在效率和性能上都更有优势，并且能够更好地被个人用户使用。考虑到不同分词方式（tokenizer）对模型性能的影响，作者也比较了不同分词方式的plant DNAMamba模型在预测不同基因组任务时的效果。结果发现基于K-mer的分词方法和基于BPE分词方法的模型在不同任务上的表现存在差异，这些差异很有可能来自于预测序列的长度，序列组成以及任务类型等。作者总结了单碱基分词，1-mer至6-mer分词以及BPE分词下模型在不同任务上的预测效果，供用户参考以选择最合适的分词方法。该研究进一步比较了DNA大语言模型和非大语言模型在植物基因组预测任务中的性能。结果发现不论是在lncRNAs任务，启动子强度任务还是开放染色质预测任务上，plant DNAMamba模型表现都优于基于CNN或者LSTM架构的专用深度学习模型。该结果反映出了DNA大语言模型的高效和普适性，仅需要单个基础模型就可以实现多种基因组任务的预测和分析。最后，作者基于所有构建的模型，开发了一个用户友好的在线预测平台，支持多种核心基因组任务的预测，同时提供了最优模型的推荐，方便湿试验人员快速进行序列分析。预测平台的访问地址为：https://finetune.plantllm.org或https://bioinfor.yzu.edu.cn/llms/finetune。综上，该研究构建了一系列植物基础DNA大语言模型，能够在单块消费级显卡上进行训练和推理，为个人或缺乏计算资源的实验室提供了选择。此外研究展现了植物基础DNA大语言模型在基因组预测中的强大能力，构建的DNA大语言模型和植物基因组预测数据，为后续更高性能的DNA大语言模型的开发提供了参考。可以预见DNA大语言模型的完善将为解析复杂的生命现象、推动作物改良事业作出不可替代的贡献。
[学术文献 ] 中科院微生物所揭示调控气孔运动的新机制 进入全文
Molecular Plant
2024年12月17日，中国科学院微生物研究所郭惠珊团队在 Molecular Plant 杂志发表题为“N6-methyladenosine on the natural antisense transcript of NIA1 stabilizes its mRNA to boost NO biosynthesis and modulate stomatal movement”的研究论文。该研究揭示了m6A甲基化修饰改变拟南芥NIA1基因反义转录本高级结构，维持NIA1 正常表达节律进而调控气孔运动的分子机制。在昼夜周期中，气孔有节奏的张开与闭合维持着植物正常生长发育，一氧化氮（NO）信号在调节气孔运动中发挥着重要作用。拟南芥硝酸还原酶基因NIA1 是NO生物合成的关键基因；在保卫细胞中，NIA1合成NO维持气孔正常闭合。团队研究发现，NIA1基因3’UTR区域转录了一条反向非编码RNA，as-NIA1。拟南芥甲基转移酶MTA介导的as-NIA1第262位腺嘌呤（Adenine，A）m6A甲基化改变了as-NIA1转录本高级结构，暴露出as-NIA1富含UC的序列，从而促进PTB3蛋白识别并结合as-NIA1；PTB3-as-NIA1复合物能够稳定NIA1基因mRNA，维持NIA1基因正常表达节律，进而影响NO在叶片和保卫细胞中的积累，调控气孔闭合。
