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[学术文献 ] 深圳湾实验室发表新型高速三维随机读取显微成像技术研究成果 进入全文
Communications Engineering
2024年11月11日，深圳湾实验室侯尚国团队联合上海交通大学仲冬平团队、南昌大学邓素辉团队，在Nature旗下期刊Communications Engineering上发表了题为“Three-dimensional random-access confocal microscopy with 3D remote focusing system”的研究论文。研究团队提出了一种新型的具有远程聚焦系统的三维随机读取共聚焦显微成像技术（3D-DyFI）。相比传统的三维随机读取成像方法，该技术在保持空间分辨率的同时，将轴向响应时间提升了34倍，实现了高达500 Hz的成像刷新率。研究团队通过荧光微球、活细胞成像及不同位置荧光珠的监测实验，验证了3D-DyFI技术的有效性。该技术有望为细胞生物学、神经科学及疾病研究提供更加快速、精准的成像手段。并且该论文被选录于“Microscopic Imaging in Deep Tissue”专辑。3D-DyFI系统采用635 nm、561 nm和488 nm激光作为激发光源，支持多色成像。激光经消色差双合透镜扩束后进入三维动态聚焦系统（3D Galvo），该系统由两个正交振镜和一对平凹透镜组成，可精确控制激光焦点在三维空间中的位置。激光经扫描筒镜进入物镜，有效减少因振镜扫描带来的场畸变和像差。荧光信号经物镜收集，并通过三维动态聚焦系统实现去扫描，最后由雪崩光电二极管（APD）检测记录。实验结果显示，3D-DyFI的成像点扩散函数（PSF）与传统压电平台相当，验证了其高空间分辨率。进一步表明系统在x、y、z轴的电压与焦点位置呈线性关系，证明了系统对激光焦点的精准控制和稳定性。为表征3D-DyFI的空间分辨性能，研究团队通过测量不同侧向和轴向位置的PSF，并在较大扫描范围（40 µm × 40 µm × 10 µm）内验证了其分辨率均匀性。实验结果显示，3D-DyFI的平均空间分辨率在x、y、z轴分别为319 ± 55 nm、405 ± 56 nm和1.10 ± 0.11 µm，且在整个成像范围内保持稳定。在时间分辨率方面，研究团队将3D-DyFI与传统压电平台系统进行对比，结果表明，3D-DyFI在x、y、z轴的响应时间分别为0.74 ms、0.82 ms和0.65 ms，显著优于传统系统（13.6 ms、9.3 ms和22.3 ms）。特别是在z轴上，3D-DyFI的响应时间提升了约34倍，实现了近乎各向同性的高速响应，这对于快速随机读取成像至关重要。研究团队进一步通过活细胞成像实验，展示了3D-DyFI在细胞结构（如细胞膜、线粒体、细胞微管和脂滴等）三维成像中的强大能力。与传统压电平台成像效果相比，3D-DyFI表现出高度一致性，验证了其在生物样本成像中的可靠性。在随机读取成像实验中，3D-DyFI与压电平台系统对比测试了三维空间中不同位置的荧光珠信号。结果显示，3D-DyFI的成像刷新率可达500 Hz，比传统系统快25倍，实现了对生物系统中动态事件的毫秒级观测。这种高速成像能力为研究细胞内快速变化的生物过程提供了强有力的工具。综上所述，3D-DyFI作为一种创新的三维随机读取共聚焦显微成像技术，展示了多方面的显著优势：（1）该系统通过远程聚焦避免了移动样品或物镜带来的机械运动干扰；（2）通过使用三维动态聚集系统，显著提升了三维随机读取成像速度；（3）系统搭建成本低，对预算不充足的实验室友好；（4）可进行多色成像和多光子成像。3D-DyFI有望在细胞生物学、神经科学等领域得到广泛应用，帮助实时监测细胞内分子动态变化。未来，3D-DyFI有望与其他技术融合，进一步提升性能，在生物医学研究中发挥重要作用。
[学术文献 ] 中国药科大学研究更新数据库DRAMP 4.0专门用于抗菌肽的临床转化 进入全文
Nucleic Acids Research
2024年11月11日，中国药科大学郑珩及劳兴珍共同通讯在Nucleic Acids Research （IF=16.6）在线发表题为“DRAMP 4.0: an open-access data repository dedicated to the clinical translation of antimicrobial peptides”的研究论文，该研究在抗菌肽数据库（DRAMP）的更新中，增加了对血清和蛋白酶稳定性的新注释，并更新抗菌肽的溶血/细胞毒性信息。DRAMP 4.0目前拥有30 260个条目（新增8 001个），包括11 612个一般条目、17 886个专利条目、96个临床条目、377个特定条目、110个稳定性数据条目和179个扩展条目。2891个条目包含实验确定的溶血活性信息，2674个条目包含实验验证的细胞毒性数据。该更新还包括新的注释、统计、类别、函数和下载链接。DRAMP可在线访问http://dramp.cpu-bioinfor.org/。耐多药细菌被广泛称为超级细菌，严重威胁着公众健康。使问题更加复杂的是，抗菌素研究和开发管道缺乏结构多样性。抗菌肽具有广谱抗菌活性和多种作用机制，且相对难以诱导耐药，被认为是治疗多重耐药细菌感染的潜在候选者。近年来，高通量测序和宏基因组学，特别是微生物组学的突破，为抗菌药物提供了大量资源。人工智能（AI）和肽合成技术的进步也极大地刺激了AMPs的设计和发现。为了有效地利用AMPs信息的快速增长，在定期更新的数据库中收集和存储数据至关重要。抗菌肽数据库APD于2008年发布，主要收集天然来源的抗菌肽，现已更新为APD3。DBAASP目前是3.0版本，包含21,957个单体，382个多聚体和236个多肽。CAMPR4包含24243个AMPs序列，933个结构和2143个专利AMPs。dbAMP2.0包含26447个抗菌蛋白和2262个抗菌蛋白。研究构建了手动标注的数据库DRAMP，该数据库于2016年发布，最初包含17 349个AMPs。经过定期更新，最新版本的DRAMP3.0包含22 259个条目。尽管越来越多的人关注并发现了数千种AMPs，但它们中很少有进展到临床试验阶段。在临床分组中，目前只有96例AMPs被报道参与了临床试验。其临床转化的主要障碍包括显著的宿主毒性、体内稳定性差、血清存在时活性降低和生产成本高。天然AMPs很容易被酶水解或降解，导致半衰期短，体内清除迅速。AMPs的这些固有缺点为肽药物开发带来了挑战，也为其设计和优化带来了机遇。目前，大多数AMP数据库，如DBAASP、CAMP、LAMP、APD、dbAMP，以及之前的版本DRAMP3.0都加入了溶血/细胞毒性注释，但都没有系统地收集AMP的半衰期数据。PEPLife数据库致力于收集肽半衰期信息，但自2016年以来一直没有更新，目前无法访问。研究在DRAMP4.0中增加了血清稳定性或半衰期的新注释。与之前的版本相比，DRAMP 4.0增加了8000多个条目。具体来说，已经添加了110种具有实验确定的稳定性信息的抗菌肽（AMPs）。在序列修改、分类和细胞毒性/溶血注释方面也进行了系统的更新。此外，研究鼓励用户在提交页面上分享他们在AMPs方面的专业知识，参考已发表的参考文献和可信的临床试验。按照《Scientific Data Journal》要求的公开共享协议，研究将原始代码上传到GitHub，肽数据上传到Figshare，并以CC许可方式免费下载和共享。所有数据都可以从下载页面下载，包括完整的数据表或按不同子集分类的表。
[学术文献 ] 南京中医药大学等合作研究构建级联激活纳米平台 进入全文
ACS Nano
2024年11月4日，南京中医药大学韩欣、孙兆瑞和南京邮电大学陆峰共同通讯在ACS Nano 在线发表题为“Triggered Cascade-Activation Nanoplatform to Alleviate Hypoxia for Effective Tumor Immunotherapy Guided by NIR-II Imaging”的研究论文。该研究以二氧化硅涂层的第二近红外窗口（NIR-II）硫化银量子点作为载体，负载成簇的规则间隔的短回文重复序列/Cas9（CRISPR/Cas9）系统，以靶向缺氧诱导因子-（HIF-1α）并引导肿瘤靶向成像。为减少非肿瘤细胞的脱靶效应，设计了TME触发的级联激活纳米诊疗平台（AA@Cas-H@HTS），调控前药替拉帕扎明（TPZ）的乏氧激活和CRISPR/Cas9核糖核蛋白的时空释放。基因编辑和TPZ激活消除HIF-1α的协同作用大大缓解了肿瘤缺氧。重要的是，靶向HIF-1α会破坏程序性细胞死亡1/程序性细胞死亡配体1（PD-1/PD-L1）信号通路，从而有效地重塑免疫抑制TME并激活T细胞介导的抗肿瘤免疫。综上所述，该研究提供了一个TME触发的级联激活纳米平台来缓解缺氧，有效改善了癌症免疫治疗效果。肿瘤缺氧在人类和动物实体瘤中普遍存在，是肿瘤微环境中最突出的临床生物标志之一，导致许多治疗方法失效。肿瘤缺氧对癌细胞的生物学行为和恶性表型有深远影响，是癌症治疗的最佳靶点之一。缺氧激活的前药，如替拉帕嗪（TPZ），对缺氧细胞表现出高毒性，而在常氧区域表现出低毒性。然而，临床试验表明，单独使用缺氧激活的前药疗效有限。为了提高抗肿瘤效果，将缺氧激活的前药与基因编辑相结合以重塑免疫抑制性肿瘤微环境（TME），可能会产生意想不到的结果。值得注意的是，与常氧区相比，缺氧区表现出缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）的高表达，与CD8+ T细胞群和CD4+ T细胞群呈负相关，并通过上调程序性细胞死亡配体1（PD-L1）等免疫检查点分子的表达来加强免疫抑制。上述发现表明，HIF-1α与肿瘤中的免疫浸润程度和免疫抑制状态有关，可能是低氧肿瘤免疫治疗的靶点。因此，开发一种靶向HIF-1α的TPZ药物递送纳米平台对于通过重塑肿瘤免疫抑制微环境进行缺氧肿瘤治疗至关重要。有多种方法来沉默HIF-1α基因，其中，成簇的规则间隔短回文重复序列/Cas（CRISPR/Cas9）是一种有效方法，可永久调控靶基因的表达。高效递送由单个向导RNA（sgRNA）与Cas9蛋白结合形成的Cas9核糖核蛋白（RNP）复合物已经取得了重大进展。如负载刺激响应成分-S-S–用于谷胱甘肽反应，–HC═NNH用于pH响应，–N═N–用于缺氧反应，时空控制Cas9 RNP的释放，实现了高效递送。然而，复杂的肿瘤微环境中过表达的物质也存在于正常细胞和血浆中。因此，在识别复杂和动态的病理状况时，肿瘤微环境中的单一反应因素可能会导致不确定性，发生Cas9RNP的非特异性释放，存在安全问题。利用肿瘤微环境的多种病理状态来区分肿瘤和正常组织，实现药物的精确释放意义重大。因此，开发包含CRISPR/Cas9受控递送和精确药物释放的新方法至关重要，这些方法可能依赖于在肿瘤微环境中相同时空坐标中多个触发因子的顺序激活，以增强癌症治疗的安全性。该研究介绍了一种“三重锁定”多功能纳米颗粒（AA@Cas-H@HTS），顺序响应肿瘤微环境中的GSH、透明质酸酶（hyal）和缺氧，从而实现CRISPR/Cas9系统的精确递送。由于Ag2S量子点在NIR-II区域的光致发光效果和可忽略不计的毒性，提供了更强的穿透深度和生物相容性。随后，在Ag2S量子点上涂敷一层介孔二氧化硅，使其具有亲水性，并为Cas9蛋白的负载提供较大的表面积。Cas9 RNP通过缺氧激活的偶氮键与二氧化硅涂层的硫化银量子点（Ag2S@SiO2）结合，形成第一层防御。同时，疏水性前药TPZ和亲水性透明质酸（HA）偶联得到两亲性TPZ改性透明质酸聚合物（HT）。Cas9 RNP核心通过自组装效应封装在HT中，形成第二层防御。随后，使用二硫键进一步交联HT以形成第三层防御（HTS）。HTS聚合物层可以增强纳米颗粒的血液循环，并赋予其特定的肿瘤靶向能力，该过程可以通过基于Ag2S的NIR-II成像来证明。靶向HIF-1α基因有助于CD8+ T细胞和CD4+ T细胞的募集，同时影响PD-L1的表达，调控PD-1/PD-L1检查点通路，重塑免疫抑制TME。此外，TPZ还可以通过降低HIF-1α表达协同促进免疫重塑。综上所述，该研究构建的精确可控级联激活多功能纳米平台可以通过TPZ和基因编辑的协同干预，缓解免疫抑制性TME，从而有效激活T细胞介导的抗肿瘤免疫。
[学术文献 ] 美圣路易斯华盛顿大学等揭示DNA甲基化酶功能分化机制 进入全文
Science Advances
2024年11月6日，美国圣路易斯华盛顿大学钟雪花教授课题组、加州大学河滨分校宋吉奎教授课题组以及河南大学蒋建军教授合作，在《Science Advances》上发表了题为“Substrate specificity and protein stability drive the divergence of plant-specific DNA methyltransferases”的研究论文，揭示了CMT2和CMT3产生功能分化的机制。这是该团队继2022年解析CMT3特异甲基化CHG的分子机制后的又一项重要进展。在此前的研究中，研究人员发现玉米CMT3蛋白ZMET2的一个关键精氨酸残基（R804）与甲基化位点后第2位（+2）G通过形成氢键，实现对CHG的特异性识别，从而维持其甲基化。在最新的研究中，他们发现CMT2中识别+2 G的关键精氨酸位点发生了变异，导致失去对CHG的特异性识别能力。有趣的是，CMT3几乎存在于所有绿色植物中且功能保守；而CMT2仅存在于被子植物中，在一些基部被子植物如无油樟中，其CMT2的该位点依旧保持为精氨酸，表明CMT2是由CMT3分化而来。将拟南芥CMT2的该位点突变为精氨酸（V1200R）后，CMT2甲基化CHG的能力显著增强，可大量甲基化CHG，抑制转座子并改变多个基因的表达，证明CMT2中该位点的变异是导致功能分化的关键因素。在苔藓植物中，异染色质区CHH的主要由DNMT3维持，但DNMT3在被子植物中缺失。CMT2的出现弥补了这一缺失对CHH甲基化的影响，并可能具备更高效的CHH甲基化能力。与CMT3相比，CMT2不仅改变了底物特异性，还具有更长的N末端。该长N末端可以追溯到基部被子植物无油樟，呈现无序状态，仅含数个相对保守的基序和核定位信号。通过蛋白含量检测和N末端交换实验发现，该长N末端可导致CMT2蛋白稳定性降低，特别是在高温下引发蛋白的快速降解，意味着CMT2更容易响应环境变化。由于CMT2长N末端的无序特性，其在物种间和物种内部均表现出较大变异。在拟南芥自然群体中，CMT2的大量自然变异集中于N末端。然而，许多品系中的变异没有明显影响整体DNA甲基化水平，表明CMT2的长N末端对自然变异高度容忍，可能通过重新翻译产生功能性CMT2蛋白。为了验证CMT2的功能，研究人员调查了更多拟南芥自然群体，发现来自西藏的拟南芥Lhasa-0（由复旦大学钟扬教授采集）的CMT2在甲基化酶功能区发生移码突变，导致整体CHH甲基化程度下降。综上所述，该研究揭示了CMT2和CMT3分别维持不同DNA甲基化的机制。CMT2拥有与CMT3类似的催化机制，但由于氨基酸变异失去了对CHG的特异性。CMT2是在被子植物中由更古老的CMT3通过复制和分化而来，具有长的无序N末端，影响其蛋白定位和稳定性。这一研究为理解DNA甲基化酶的进化及其在环境响应中的角色提供了新的视角。
[学术文献 ] 中科院版纳园提出植物根系分泌物-功能微生物组互作研究的新模型 进入全文
The ISME Journal
11月4日，中国科学院西双版纳热带植物园的研究人员相关研究成果近日以Probiotic model for studying rhizosphere interactions of root exudates and the functional microbiome为题在线发表于The ISME Journal。该研究提出了一种新的植物功能基因（转运蛋白）-根系分泌物-功能微生物组级联调控的根际互作研究模型，并就宿主（代谢物）-功能微生物（及保卫微生物）-环境（病原）微生物间的稳态维持机制提出假设，该模型或有助于加深对根系生物学功能与根际微生物稳态维持的见解。研究人员首先发现典型的根系分泌物（气生根黏液）与地下根系分泌物化学组成显著不同，玉米和高粱等禾本科为主的气生根植物黏液富含碳水化合物、半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖和特殊的黏聚多糖，而地下根系分泌物则富集了更高含量的脂类、生物碱和酚酸。气生根黏液富含大量的碳水化合物和其他代谢物，为微生物活动和其他生物学过程提供充足的碳源、营养物质、湿润环境和保护性的屏障。此外，微生物组测序和培养组结果表明不同栖息地植物黏液微生物组的群落结构较为相似，如均富集了潜在的固氮菌，如高丰度的克雷伯氏菌Klebsiella、草螺菌Herbaspirillum、微杆菌Microbacterium和固氮螺菌Azospirillum。研究人员进一步利用微生物组功能注释、固氮能力检测和分子生物学等证据，综合全球范围内其他禾本科植物的研究发现类似的黏液固氮菌和气生根-黏液系统均可以帮助宿主固氮并促进宿主生长。这种气生根黏液富集潜在固氮微生物的现象表明，黏液-微生物组系统可能对这些植物的固氮过程至关重要，然而，宿主如何选择这些功能固氮菌并维持其在根际黏液微环境中的功能与稳态的机制仍不清晰，或需特殊的实验模型来加深对植物代谢物如何介导宿主-功能微生物组互作过程和稳态机制的理解。根系特异性代谢物和微生物的互作被认为是宿主调控根际微生物组装的关键因子。因此，理解根系分泌物塑造和调控植物微生物组的潜在机制对于促进植物生长和健康至关重要。同时，基于研究者此前关于双子叶植物的相关报道同样证明了黏液微环境中微生物组的动态平衡，且这一过程是由黏液内部微生物重要成员：保卫真菌（Gatekeepers fungus）所调控的，该菌可以产生抗菌物质特异性地抵御病原菌和环境微生物，却不抵御同域的固氮菌，该保卫微生物在宿主全植株“伴生”且在黏液微生境中与宿主建立有益的伙伴关系。鉴于在多点多物种均报道了这一典型且稳定的气生根黏液-功能微生物组的生物互作进展，研究者进一步提出将气生根黏液-益生菌系统作为一种研究根系分泌物-功能微生物互作的新模型。在这个实验模型中，研究者选择三种单子叶禾本科植物和一种双子叶藤本植物，检测其气生根黏液和地下根系分泌物和微生物组的异同。其中，功能微生物组包含能够在气生根黏液微生境中进行固氮或维持微生物群稳态的功能菌和保卫微生物（Gatekeepers microbes）。该研究模型中研究者的科学假设和研究方法主要包含以下四个途径：（1）确定黏液代谢物和微生物组的共性从而建立根系分泌物和功能微生物组之间的联系：分析不同气生根黏液植物的共有代谢物与核心微生物组。黏液微生境和地下根际根系分泌物和微生物组的差异也能为挖掘功能化合物成分提供线索（图3a）。（2）验证根系分泌物和功能微生物组之间的互作关系，例如，关联代谢物和微生物组组分，一方面根系分泌物可以调控功能，而功能微生物也可以参与黏液化合物的代谢过程。（3）确定黏液微生境中的功能组成，包括调控功能微生物组和微生物群稳态的关键代谢物和微生物。（4）植物-功能微生物组的微进化分析，从微进化的视角解析多种植物中气生根黏液性状的形成和调控功能微生物互作过程和潜在机制（如调控微生物组的Microbiome基因）。最后，研究者提出可采用多组学方法（基因组、转录组、代谢组和微生物组）与分子生物学实验等分析、验证宿主黏液代谢物和微生物组的互作，并探究根际生态位中微生物稳态的调控机制。这个模型为特殊黏液分泌物与根际微生境中微生物功能和稳态维持机制提供了新的见解，有助于明确宿主对其微生物群落的功能的调控因子与微生物稳态互作机制。
[学术文献 ] 农科院深圳农业基因组所构建食物微生物组数据库FoodMicroDB 进入全文
iMetaOmics
2024年11月1日，中国农业科学院深圳农业基因组研究所刘永鑫团队和中国中医科学院国家中药资源中心陈同等在iMetaOmics在线发表了题为 “FoodMicroDB: a microbiome database for composition and time-series research in food”的文章。该研究构建了一个具备丰富数据分析和可视化功能的食物微生物组数据库，收集了来自62种食物的108个扩增子测序项目数据，促进了食物微生物组数据的可访问性和可重用性，为该领域提供了一个有价值的资源平台。
