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[学术文献 ] 中国农科院/清华大学合作开发基于人工智能的DNA顺式调控元件设计新方法 进入全文
Nucleic Acids Research
2024年10月18日，中国农业科学院深圳基因组研究所刘毓文团队和清华大学倪建泉团队合作在Nucleic Acids Research在线发表了题为“A novel interpretable deep learning-based computational framework designed synthetic enhancers with broad cross-species activity”的研究论文。该研究开发了DREAM（DNA cis-Regulatory Elements with controllable Activity design platforM，DREAM）的计算框架，旨在彻底变革增强子等顺式调控元件的设计方式。DREAM代表DNA顺式调控元件的可控活性设计平台，这个名字恰如其分地反映了其核心功能。DREAM具有高度的可扩展性和解释性，能够自动从头设计具有用户理想性质的启动子、增强子、沉默子。通过深度学习技术，DREAM自动学习和识别与调控活性相关的DNA“词汇”，并基于这些知识精确预测增强子的活性。基于该方法，研究人员首次设计出了在超过10亿年分化物种（包括哺乳动物、鸟类、鱼类、昆虫和酵母等）中具有保守功能的增强子序列，揭示了增强子调控语法的跨物种保守性。此外，设计出的超强增强子活性显著高于不同物种中常用的最强增强子，同时也首次设计出了基因表达抑制效果显著的沉默子序列，为合成生物学基因表达操作提高了新的高效元件。最后，研究人员还将设计的增强子成功整合入果蝇基因组中，首次获得了携带人工智能设计调控元件的成体动物。在成体果蝇中，报告基因的表达量提升了1万倍以上，为基于CRE元件优化的合成生物学育种提供了重要理论依据和技术参考。通过基于Squeeze-and-Excitation注意力机制的深度学习技术 (SENet)，DREAM自动学习和识别与调控活性相关的DNA“词汇”，并基于这些知识精确预测增强子的活性。研究表明，与现有的其他基于序列预测功能的模型相比（包括Nature中首次增强子设计用到的DeepSTARR算法），DREAM的增强子活性预测模块在准确性和性能上有显著提升。此外，DREAM兼具超高的元件活性性能预测能力以及良好的生物学可解释性，因此DREAM可以将学习到的增强子的调控语法用于后续的元件设计任务之中。在PCC、MSE等四项指标上，DREAM均超越目前主流的顺式调控元件预测模型。同时DREAM能够有效地捕获调控元件相关的DNA motif的特征。同时基于该框架，作者揭示了增强子元件中motif具有的位置效应以及距离依赖的上位性效应。由于其透明性，用户可以明确地了解在调控元件的设计和优化过程中，元件活性有关的重要的DNA特征是如何被利用和组织的。研究人员利用DREAM模拟了果蝇基因组中发育增强子和持家增强子进化动态，并成功设计出具有超强活性的增强子元件。这些元件的序列分析表明设计序列在motif的数目，空间排布、多样性、结合力以及GC含量等方面具有与自然元件截然不同的性质。作者合成了增强子DreaMer001，通过双荧光素酶实验测定其活性达到了果蝇基因组中最强天然增强子的3.6倍，同时构建了转基因果蝇在体内测量了该元件元件的活性，结果表明该元件在果蝇体内可以提高报告基因转录活性约10000倍，进一步证明了该元件具有极强的增强转录活性的能力。更为重要的是，这些经过DREAM设计的高活性合成增强子不仅在果蝇S2细胞中表现出超高的活性，还在包括人类、小鼠、猪在内的多种物种的不同细胞系中具有超强的活性（平均为CMV增强子活性的2倍以上），在SF9细胞中DREAM设计的增强子活性是Hr5增强子活性的15.7倍，另外该人工设计元件在鸡（DF1细胞）以及鱼（精原细胞）分别是CMV增强子活性的7.6倍和26.6倍。这表明DREAM有能力通过计算设计比自然进化产生的更高效的基因调控元件，也揭示了增强子调控语法的跨物种保守性。另外，DREAM框架具有的良好可扩展性，作者进一步展示了细胞特异性的强增强子，高AT含量超强增强子，具有固定酶切位点强增强子，以及强沉默子元件的设计。值得注意的是，作者利用DREAM获得了能够降低基因表达44.7倍的超强沉默子DreaMer002。这些结果证明了DREAM的设计成果在实际应用中具有广泛的应用场景和可靠性。
[学术文献 ] 中科院微生物所研究设计新型猴痘mRNA疫苗 进入全文
eBioMedicine
2024年10月17日，中国科学院微生物研究所高福院士和王奇慧研究员团队在eBioMedicine 发表论文，题为Single-chain A35R-M1R-B6R trivalent mRNA vaccines protect mice against both mpox virus and vaccinia virus。团队针对猴痘病毒设计了一系列嵌合三价mRNA疫苗。高福院士/王奇慧团队基于结构生物学指导的疫苗研发平台，采用与新冠病毒重组蛋白亚单位疫苗相似的策略，创新性地设计出嵌合三价mRNA疫苗。该疫苗在小鼠中可诱导出高效的体液免疫与细胞免疫，维持抗体水平在免疫近6个月后基本不变，实现了致死剂量痘苗病毒攻毒后对小鼠的完全保护，并可在猴痘病毒攻毒后显著降低小鼠多个器官中的病毒载量。同样痘苗病毒剂量下，接种痘苗天坛株减毒活疫苗（VACV-VTT）的小鼠全部死亡。作为嵌合mRNA疫苗，该疫苗以单链mRNA编码了3种猴痘病毒抗原，与混合疫苗相比具备更低的生产难度，因而有望获得更大的成本优势、更简单的生产工艺以及更广的疫苗可及性。
[学术文献 ] 华中农大开发柑橘黄龙病纳米颗粒新技术 进入全文
International Journal of Biological Macromolecules
近日，华中农业大学农业微生物资源发掘与利用全国重点实验室、纳米化学生物学团队韩鹤友教授课题组在International Journal of Biological Macromolecules发表题为“A Two-in-One Molybdenum Disulfide-Chitosan Nanoparticles System for Activating Plant Defense Mechanisms and Reactive Oxygen Species to Treat Citrus Huanglongbing”的研究论文。该论文详细研究了柑橘黄龙病的纳米防治新技术。该研究制备了一种壳聚糖修饰的纳米二硫化钼抗菌体系，主要研究内容及结果如下：（1）MoS2-CS NPs通过引起细菌表面膜皱缩和物理刺穿，破坏了细菌的细胞结构；上调了抗氧化酶活性，降低ROS给植物带来的损伤；显著增强了MoS2的抑菌活性。2）体外模拟抗菌试验结果显示，对黄龙病菌同属的根瘤菌RM1021、柑橘溃疡菌、软腐菌的抑制效果均达到90%；在活体植株上对黄龙病菌抑制效果达90%。（3）过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）分别上调114.33%、141.12%及相关基因分别上调5.78±1.94倍和4.53±1.87倍，减轻了氧化应激对植物的损害。综上，本研究为柑橘黄龙病的防治提供了一种纳米技术新策略
[学术文献 ] 中国农业大学解析玉米驯化新基因tsh4调控株型穗型发育机制 进入全文
Nature Genetics
2024年年10月16日，Nature Genetics 杂志在线发表了中国农业大学董朝斌课题组与合作者的研究论文“A regulatory network controlling developmental boundaries and meristem fates contributed to maize domestication”, 研究了玉米驯化过程中控制发育边界和分生组织命运的调控网络。研究人员通过染色质免疫沉淀测序结合全基因组关联分析，发现了一个新的玉米驯化基因tasselsheath4（tsh4），它通过双重负反馈回路调控自身表达，影响多个驯化位点。TSH4蛋白与一对同源基因UB2和UB3功能冗余，正向调控一系列驯化位点，提高产量。研究还发现，tsh4在现代玉米中受到正向选择，表明它在驯化过程中起到了关键作用，有助于形成理想的作物植物结构。这项研究不仅揭示了玉米驯化的重要分子机制，还为作物改良提供了潜在的基因资源。
[学术文献 ] 浙大农学院公布麦田杂草菵草基因组并揭示其群体结构与进化历程 进入全文
Plant Communications
2024年10月16日，浙江大学农业与生物技术学院在Plant Communications期刊在线发表了题为“Assembling a reference-quality genome and resequencing diverse accessions of Beckmannia syzigachne provide insights into population structure and gene family evolution”的论文。该研究公布了麦田恶性杂草菵草（Beckmannia syzigachne）的高质量参考基因组，揭示了中国菵草的群体结构与进化历程，为未来菵草的有效管理及杂草基因组学研究提供了重要的基因组数据资源。研究团队利用PacBio-HiFi技术及高通量染色体构象捕获（Hi-C）数据，整合了多种高性能de novo组装工具的优势，成功组装了包含7条染色体、总长度2786.6 Mb的高完整性和高连续性的菵草基因组（BUSCO, 99.1% 完整性；LAI=21.2；平均QV=57.35），其中重复元件占基因组总长度的88.28%。除6号染色体上的1个高杂合间隙外，其余6条均达到端粒至端粒（T2T）水平，全面描绘了菵草7条染色体的端粒和着丝粒区域。通过对基因组的注释，共预测了48,711个基因。通过比较基因组学分析，发现菵草经历了两次潜在的全基因组复制（WGD）事件，导致与资源获取和能量代谢相关的基因家族显著扩张，可能增强了菵草在多变环境中的适应能力。同时，非靶标抗性（NTSR）基因家族的显著扩张，为其快速适应除草剂逆境提供了遗传基础。此外，研究团队对来自中国11个省市、7种不同生态系统的110个菵草样本进行了重测序，系统研究了其遗传多样性和群体结构。系统发育结果显示，尽管东北和西南地区的菵草样本地理距离遥远，但它们的遗传相似性较高。而来自长江中下游地区的样本，群体间遗传分化水平很低，显示出快速扩散的趋势。比较基因组分析发现，菵草的遗传多态性（π=1.189×10-5）显著低于其他杂草，这可能与其高自交率、农业管理实践以及遗传瓶颈效应相关。在全球环境不断变化的背景下，深入研究植物适应性进化的遗传基础对于推动可持续农业发展和保护植物多样性至关重要。本研究成果为菵草等杂草的基因组学研究提供了宝贵资源，并为植物在快速变化环境中的适应性提供了新的视角。
[学术文献 ] 西南大学开发简单PAM识别的CRISPR-Mb3Cas12a植物编辑系统 进入全文
Plant Biotechnology Journal
2024年10月10日，Plant Biotechnology Journal在线发表了由西南大学/电子科技大学张勇教授及其合作团队撰写的“PAM‐relaxed and temperature‐tolerant CRISPR‐Mb3Cas12a single transcript unit systems for efficient singular and multiplexed genome editing in rice, maize, and tomato”研究论文。该研究在对比测试了源于Helcococcus kunzii、Moraxella bovoculi、Pseudobutyrivibrio ruminis的CRISPR-HkCas12a、CRISPR-Mb3Cas12a, CRISPR-PrCas12a编辑活性及特性基础上，针对其中识别5’-TTV-3’简单PAM基序的Mb3Cas12a进行系统性工作，通过优化Mb3Cas12a核酸酶及crRNA骨架序列的关键功能元件及基序序列、核酸酶活性及稳定性相关关键氨基酸改造，构建了高效基于单转录单元（STU）的Mb3Cas12a植物基因组编辑系统。进一步应用工作中，在水稻、玉米及番茄中，实现了有效的蛋白编码基因敲除编辑、启动子调控序列编辑、microRNA功能性敲除编辑，丰富了植物基因组编辑工具箱。研究者首先基于所在团队之前开发的双Pol II启动子驱动的Cas12a植物基因组编辑骨架底盘，针对三个Cas12a同系物（HkCas12a、Mb3Cas12a、PrCas12a）构建了植物基因组编辑骨架载体。进而，基于“原生质体瞬时转化+扩增子通量测序”策略，在水稻细胞中评估了其在5’-VTTTV-3’ PAM位点和5’-VTTV-3’ PAM位点的编辑效率。实验结果表明：HkCas12a在5’-TTTC-3’和5’-TTTG-3’位点上显示较高编辑效率（36.4%-60.8%），但在5’-VTTTA-3’位点上效率较低（8.3%）；Mb3Cas12a在所有位点上显示40.0%以上的平均编辑效率，与LbCas12a相当；PrCas12a在5’-TTTG-3’位点上显示出较高编辑效率（>40.0%），但在5’-TTTA-3’和5’-VTTTC-3’位点上效率较低（3.9%-7.3%）。同时，在5’-VTTV-3’ PAM位点的编辑效率，Mb3Cas12a也在所有位点上显示了高效的编辑活性。进一步水稻稳定转化实验中，针对水稻内源基因，测试了Mb3Cas12a在3个5’-TTTV-3’ PAM位点和5个5’-TTV-3’ PAM位点的稳定编辑效率。实验结果表明，Mb3Cas12a在所有目标位点均实现了有效编辑，5’-TTTV-3’ PAM位点的编辑效率为70.0%-100%，5’-TTV-3’ PAM位点的编辑效率为20.0%-70.0%。进一步的通量编辑数据分析，发现HkCas12a、Mb3Cas12a及PrCas12a在水稻细胞中显示多样化的编辑特性：1）3个新Cas12a编辑工具诱导的突变主要是多碱基删除，且删除编辑事件为6bp-12bp的删除，删除位置在PAM远端13到27nt；3）使用存在碱基错配的spacer时，3种Cas12a除对PAM远端3bp的错配表现一定容错外，均体现了明确的高特异性；4）HkCas12a和Mb3Cas12a在crRNA长度为19到23nt时可以产生有效编辑，而PrCas12a需要更长的spacer来实现有效编辑。进一步，针对3个水稻内源基因靶位点（OsDEP1-crR1、OsROC5-crR2、OsmiR528-crR3），研究人员基构建、比较了单个Pol II启动子的STUHDH和双Pol II启动子的Dual Pol II多基因共编辑系统。稳定遗传转化单株的Sanger测序分析结果显示，基于双核酶的STUHDH和Dual Pol II系统具有相当的多重编辑效率，在所有靶位点上产生了94.1%-100%的突变。其中STUHDH系统的双等位基因编辑效率范围为41.2%-94.1%，与Dual Pol II系统相当（61.1%-94.4%），并且大多数植株在3个靶基因上产生了共编辑。考虑到基于双核酶的Mb3Cas12a STUHDH系统相较于Dual Pol II系统，具有结构简单、元件利用率高的优势，研究人员针对STUHDH系统进行进一步优化：1）优化了Mb3Cas12a和crRNA之间的linker序列，比较了Triplex、Comp.14以及初始STUHDH版本中的PolyA三种结构，发现PolyA在三种结构中表现突出（效率范围从23.7%-42.2%），Comp.14的编辑效率略低于PolyA（效率范围从12.1%-38.3%），而Triplex与PolyA相比编辑效率显著降低（效率范围从14.7%-27.1%）；2）优化NLS结构，比较了3C NLS（3x SV40 NLS位于Cas12aC端）、2C NLS（SV40 NLS-np NLS位于Cas12aC端）以及原始载体中使用的NC NLS（SV40 NLS与np NLS分别位于Cas12aN端和C端，发现NC NLS在三个系统中表现突出（效率范围从36.2%-69.1%），3C NLS的编辑效率略低于NC NLS（效率范围从32.5%-60.5%），而2C NLS总体上编辑效率较低（效率范围从8.5%-65.2%）；3）优化DR结构，分析了六个具有不同loop序列的DR（4n61、4n91、4n96、4n128、4n137、4n149）以及Mb3Cas12a的DR（Mb3 DR）在水稻内源位点上的编辑活性，发现4n96 DR在所有7个DR中效率最高（效率范围从17.3%-59.3%），4n61 DR和4n91 DR与Mb3 DR显示出相当的活性，编辑效率范围分别为9.6%-46.2%、10.9%-42.9%。综上结果，该研究通过使用PolyA、NC NLS和4n96 DR，开发了高效的Mb3Cas12a STUHDH植物基因组编辑系统。Cas12a核酸酶对低温敏感，研究人员进一步对Mb3Cas12a核酸酶D172、N573和K579关键氨基酸，设计了3个Mb3Cas12a变体，Mb3Cas12a-R（D172R）、Mb3Cas12a-RRR（D172R/N573R/K579R）、Mb3Cas12a-RVRR（N573R/K579V/N583R/K635R），并基于优化的STUHDH系统进行室温编辑能力评价。结果显示：32°C时，Mb3Cas12a、Mb3Cas12a-R和Mb3Cas12a-RRR显示出相当的编辑效率（平均效率分别为42.7%、43.0%和45.4%）；在28°C时，Mb3Cas12a显示编辑效率降低，而Mb3Cas12a-R和Mb3Cas12a-RRR在保持了高编辑效率；在22°C时，所有Mb3Cas12a基因组编辑效率均有下降，但Mb3Cas12a-R和Mb3Cas12a-RRR变体在大多数靶位点上显示了超过15.0%的编辑效率，比野生型Mb3Cas12a高出两倍。研究人员使用优化的Mb3Cas12a STUHDH系统针对水稻重要农艺性状相关基因进行启动子编辑。首先，针对OsGBSS1启动子设计了12个crRNA，对19个T0植株的分析显示，稳定转化材料在多个靶位点上实现了有效编辑，其中编辑事件为多碱基删除。进一步分析了五个纯合T1启动子编辑植株，这些植株携带了不同大小的删除，且启动子编辑水稻植株中OsGBSS1表达水平及籽粒中直链淀粉含量有效降低，其他主要农艺性状与WT植株相似。研究人员进一步针对水稻OsD18启动子设计了12个crRNA，基于优化的Mb3Cas12a STUHDH系统构建了OsD18启动子多重编辑系统，对18个T0株系的分析显示，稳定转化材料在靶位点上实现了多碱基删除有效编辑。对4个携带了不同大小删除的纯合T1水稻株系进行分析，发现这些启动子编辑株系中OsD18表达水平降低,植株呈现半矮化（平均高度从78.5cm-98.0cm，WT植物平均株高为106.0cm），除主穗的长度和主穗粒量有相对减少及分蘖数量增加外，OsD18启动子编辑株系的种子长度、千粒重和种子结实率没有显著变化。接下来，研究人员基于低温耐受的Mb3Cas12a-RRR核酸酶开发了玉米基因组编辑系统，通过玉米原生质体转化，分析了其在6个靶位点的编辑效率。其中2个位点显示了17.8%-28.6%的编辑效率，另外4个位点效率偏低（2.4%-4.6%），这表明spacer序列和基因组位置选择对玉米基因组编辑效率影响明显。同样，Mb3Cas12a-RRR在玉米中的编辑事件主要发生在PAM远端，且为8-11bp的多碱基删除。进一步，通过农杆菌介导的稳定转化方法研究人员创制了祥249（X249）玉米自交系的ZmMIR159f稳定编辑材料，在4株转基因阳性材料中，2株为多碱基删除（11bp-16bp）的编辑事件，且有效删除了ZmMIR159成熟序列区域，实现了基于Mb3Cas12a的玉米基因组非编码RNA基因的有效敲除。研究人员基于Mb3Cas12a-RRR核酸酶变体，开发了双子叶植物番茄基因组编辑工具，针对8个番茄内源靶向位点，对比了多种Cas12a编辑活性。结果显示，Mb3Cas12a-RRR在番茄中显示最佳编辑活性，所有靶位点的编辑效率均大于10.0%，编辑事件同样为多碱基删除。进一步基于Mb3Cas12a-RRR STUHDH系统，针对SlMYBATV-cR、SlGGP1-cR和SlCYCB-cR构建了多基因共编辑载体，通过农杆菌介导的稳定转化，随机选择25株转基因植株，进行Sanger测序和分析，发现SlMYBATV-cR、SlGGP1-cR和SlCYCB-cR位点的编辑效率分别为8.0%、12.0%和16.0%，双等位基因编辑效率分别为0%、12.0%和4.0%，三个基因的共编辑效率为4.0%，两个基因的共编辑效率为12.0%。481-5、481-10、481-11和481-16番茄共编辑植株果实中番茄红素含量显著增加。
