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[学术文献 ] 美圣路易斯华盛顿大学等揭示DNA甲基化酶功能分化机制 进入全文
Science Advances
2024年11月6日，美国圣路易斯华盛顿大学钟雪花教授课题组、加州大学河滨分校宋吉奎教授课题组以及河南大学蒋建军教授合作，在《Science Advances》上发表了题为“Substrate specificity and protein stability drive the divergence of plant-specific DNA methyltransferases”的研究论文，揭示了CMT2和CMT3产生功能分化的机制。这是该团队继2022年解析CMT3特异甲基化CHG的分子机制后的又一项重要进展。在此前的研究中，研究人员发现玉米CMT3蛋白ZMET2的一个关键精氨酸残基（R804）与甲基化位点后第2位（+2）G通过形成氢键，实现对CHG的特异性识别，从而维持其甲基化。在最新的研究中，他们发现CMT2中识别+2 G的关键精氨酸位点发生了变异，导致失去对CHG的特异性识别能力。有趣的是，CMT3几乎存在于所有绿色植物中且功能保守；而CMT2仅存在于被子植物中，在一些基部被子植物如无油樟中，其CMT2的该位点依旧保持为精氨酸，表明CMT2是由CMT3分化而来。将拟南芥CMT2的该位点突变为精氨酸（V1200R）后，CMT2甲基化CHG的能力显著增强，可大量甲基化CHG，抑制转座子并改变多个基因的表达，证明CMT2中该位点的变异是导致功能分化的关键因素。在苔藓植物中，异染色质区CHH的主要由DNMT3维持，但DNMT3在被子植物中缺失。CMT2的出现弥补了这一缺失对CHH甲基化的影响，并可能具备更高效的CHH甲基化能力。与CMT3相比，CMT2不仅改变了底物特异性，还具有更长的N末端。该长N末端可以追溯到基部被子植物无油樟，呈现无序状态，仅含数个相对保守的基序和核定位信号。通过蛋白含量检测和N末端交换实验发现，该长N末端可导致CMT2蛋白稳定性降低，特别是在高温下引发蛋白的快速降解，意味着CMT2更容易响应环境变化。由于CMT2长N末端的无序特性，其在物种间和物种内部均表现出较大变异。在拟南芥自然群体中，CMT2的大量自然变异集中于N末端。然而，许多品系中的变异没有明显影响整体DNA甲基化水平，表明CMT2的长N末端对自然变异高度容忍，可能通过重新翻译产生功能性CMT2蛋白。为了验证CMT2的功能，研究人员调查了更多拟南芥自然群体，发现来自西藏的拟南芥Lhasa-0（由复旦大学钟扬教授采集）的CMT2在甲基化酶功能区发生移码突变，导致整体CHH甲基化程度下降。综上所述，该研究揭示了CMT2和CMT3分别维持不同DNA甲基化的机制。CMT2拥有与CMT3类似的催化机制，但由于氨基酸变异失去了对CHG的特异性。CMT2是在被子植物中由更古老的CMT3通过复制和分化而来，具有长的无序N末端，影响其蛋白定位和稳定性。这一研究为理解DNA甲基化酶的进化及其在环境响应中的角色提供了新的视角。
[学术文献 ] 中科院版纳园提出植物根系分泌物-功能微生物组互作研究的新模型 进入全文
The ISME Journal
11月4日，中国科学院西双版纳热带植物园的研究人员相关研究成果近日以Probiotic model for studying rhizosphere interactions of root exudates and the functional microbiome为题在线发表于The ISME Journal。该研究提出了一种新的植物功能基因（转运蛋白）-根系分泌物-功能微生物组级联调控的根际互作研究模型，并就宿主（代谢物）-功能微生物（及保卫微生物）-环境（病原）微生物间的稳态维持机制提出假设，该模型或有助于加深对根系生物学功能与根际微生物稳态维持的见解。研究人员首先发现典型的根系分泌物（气生根黏液）与地下根系分泌物化学组成显著不同，玉米和高粱等禾本科为主的气生根植物黏液富含碳水化合物、半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖和特殊的黏聚多糖，而地下根系分泌物则富集了更高含量的脂类、生物碱和酚酸。气生根黏液富含大量的碳水化合物和其他代谢物，为微生物活动和其他生物学过程提供充足的碳源、营养物质、湿润环境和保护性的屏障。此外，微生物组测序和培养组结果表明不同栖息地植物黏液微生物组的群落结构较为相似，如均富集了潜在的固氮菌，如高丰度的克雷伯氏菌Klebsiella、草螺菌Herbaspirillum、微杆菌Microbacterium和固氮螺菌Azospirillum。研究人员进一步利用微生物组功能注释、固氮能力检测和分子生物学等证据，综合全球范围内其他禾本科植物的研究发现类似的黏液固氮菌和气生根-黏液系统均可以帮助宿主固氮并促进宿主生长。这种气生根黏液富集潜在固氮微生物的现象表明，黏液-微生物组系统可能对这些植物的固氮过程至关重要，然而，宿主如何选择这些功能固氮菌并维持其在根际黏液微环境中的功能与稳态的机制仍不清晰，或需特殊的实验模型来加深对植物代谢物如何介导宿主-功能微生物组互作过程和稳态机制的理解。根系特异性代谢物和微生物的互作被认为是宿主调控根际微生物组装的关键因子。因此，理解根系分泌物塑造和调控植物微生物组的潜在机制对于促进植物生长和健康至关重要。同时，基于研究者此前关于双子叶植物的相关报道同样证明了黏液微环境中微生物组的动态平衡，且这一过程是由黏液内部微生物重要成员：保卫真菌（Gatekeepers fungus）所调控的，该菌可以产生抗菌物质特异性地抵御病原菌和环境微生物，却不抵御同域的固氮菌，该保卫微生物在宿主全植株“伴生”且在黏液微生境中与宿主建立有益的伙伴关系。鉴于在多点多物种均报道了这一典型且稳定的气生根黏液-功能微生物组的生物互作进展，研究者进一步提出将气生根黏液-益生菌系统作为一种研究根系分泌物-功能微生物互作的新模型。在这个实验模型中，研究者选择三种单子叶禾本科植物和一种双子叶藤本植物，检测其气生根黏液和地下根系分泌物和微生物组的异同。其中，功能微生物组包含能够在气生根黏液微生境中进行固氮或维持微生物群稳态的功能菌和保卫微生物（Gatekeepers microbes）。该研究模型中研究者的科学假设和研究方法主要包含以下四个途径：（1）确定黏液代谢物和微生物组的共性从而建立根系分泌物和功能微生物组之间的联系：分析不同气生根黏液植物的共有代谢物与核心微生物组。黏液微生境和地下根际根系分泌物和微生物组的差异也能为挖掘功能化合物成分提供线索（图3a）。（2）验证根系分泌物和功能微生物组之间的互作关系，例如，关联代谢物和微生物组组分，一方面根系分泌物可以调控功能，而功能微生物也可以参与黏液化合物的代谢过程。（3）确定黏液微生境中的功能组成，包括调控功能微生物组和微生物群稳态的关键代谢物和微生物。（4）植物-功能微生物组的微进化分析，从微进化的视角解析多种植物中气生根黏液性状的形成和调控功能微生物互作过程和潜在机制（如调控微生物组的Microbiome基因）。最后，研究者提出可采用多组学方法（基因组、转录组、代谢组和微生物组）与分子生物学实验等分析、验证宿主黏液代谢物和微生物组的互作，并探究根际生态位中微生物稳态的调控机制。这个模型为特殊黏液分泌物与根际微生境中微生物功能和稳态维持机制提供了新的见解，有助于明确宿主对其微生物群落的功能的调控因子与微生物稳态互作机制。
[学术文献 ] 农科院深圳农业基因组所构建食物微生物组数据库FoodMicroDB 进入全文
iMetaOmics
2024年11月1日，中国农业科学院深圳农业基因组研究所刘永鑫团队和中国中医科学院国家中药资源中心陈同等在iMetaOmics在线发表了题为 “FoodMicroDB: a microbiome database for composition and time-series research in food”的文章。该研究构建了一个具备丰富数据分析和可视化功能的食物微生物组数据库，收集了来自62种食物的108个扩增子测序项目数据，促进了食物微生物组数据的可访问性和可重用性，为该领域提供了一个有价值的资源平台。
[学术文献 ] 瑞士日内瓦大学发表体内DNA复制动态图谱 进入全文
Cell
2024年10月31日，来自瑞士日内瓦大学的Thanos D. Halazonetis在Cell上发表了论文In vivo DNA replication dynamics unveil aging-dependent replication stress。在本研究中，作者揭示了体内DNA复制起始位点的激活动态，并发现了ATR抑制剂在DNA复制和细胞应激反应中的复杂作用，特别是对于衰老生物来说，抑制ATR不仅可以恢复复制起始点的活性，还会引发炎症反应，但是这种炎症可能对组织功能产生负面影响。为了研究体内DNA复制动态，研究人员选择再生小鼠肝脏作为研究模型。成年哺乳动物的肝脏细胞通常不增殖，但在部分肝切除术后，它们可以被诱导几乎同步的进入S期（DNA合成期）。因此肝脏再生提供了一个理想的研究对象，可以获得非增殖的组织（未切除的肝细胞）和同步增殖的组织（再生的肝细胞），这有助于获得体内DNA复制起始位点的详细图谱。作者通过渗入EdU（一种胸苷类似物，可以掺入新合成的DNA链中，用于标记正在进行复制的区域）和HU（一种核糖核苷酸还原酶抑制剂，可以限制复制叉的前进，帮助定位DNA复制起始点）处理，再结合高通量测序技术EdU-seq-HU，总共鉴定到3517个复制起始位点。比较不同小鼠之间的复制起始位点，发现个体之间的复制起始位点激活具有高度一致性。将DNA复制起始位点与新生转录本数据进行整合后，作者发现在全基因组范围内，复制起始位点的两侧有明显的新生转录信号，但在复制起始位点自身几乎没有转录信号，复制起始位点更多的位于基因间区域，这表明复制起始位点倾向于避开转录活跃的区域。作者进一步的分析了DNA复制起始位点与基因转录之间的关系。他们重点研究了复制与转录的方向性和复制起始位点与表达基因的距离。结果表明，复制和转录之间存在同向性的偏好，这种同向性可能有助于减少复制和转录机械装置之间的冲突，从而提高基因组复制和转录的效率和准确性。此外，复制起始位点偏好位于基因前方10–50 kb的范围内，这种定位偏好有助于确保DNA复制和基因表达的高效进行，减少可能的冲突。在对比了小鼠和人类基因组后，作者还发现复制起始位点的位置和距离在小鼠和人类之间是进化保守的。这意味着复制起始位点相对于基因转录序列的位置（位于TSS上游或TTS下游）以及它们与TSS/TTS之间的距离在进化过程中保持稳定。DNA复制应激可以诱导备用复制起始位点的启动，这些备用起始位点在正常情况下不被利用，只有在复制受阻时才被激活，以确保基因组的完整性。鉴于此，作者引入了DNA复制应激来分析这些潜在的备用起始位点是否会被激活。通过HU和ATR抑制剂（ATRi）来引发复制应激，研究发现在部分肝切除后，DNA复制应激可以激活备用复制起始位点。不同的是，这些备用位点位于表达序列的附近，但在基因的另一侧，与初始鉴定的复制起始位点相对。这表明，在DNA复制受到应激时，备用起始点可能被激活以确保基因组的复制完整性。文章的最后，作者想要了解衰老小鼠肝细胞再生时，复制起始位点的激活是否受到影响。研究人员分析了12个月、18个月和22个月的衰老小鼠在部分肝脏切除后的DNA复制起始位点激活情况。结果表明，随着小鼠年龄的增长，肝细胞再生时DNA复制起始位点的激活效率显著降低，这种激活缺陷并非受到相关基因的表达影响。这一结果为进一步研究老化过程对DNA复制和细胞再生的影响提供了新的线索。前面提到，ATRi处理可以激活备用起始位点，因此作者想要探究ATRi的这个功能是否可以作为潜在的治疗衰老引起的DNA复制起始位点激活缺陷的策略。通过注射ATRi，作者发现该抑制剂在衰老小鼠中能够恢复肝细胞DNA复制起始位点的激活效率，但是在后期诱导了明显的炎症反应。详细分析肝细胞增殖情况后发现，ATRi并未显著提高衰老小鼠中肝细胞的增殖比例，这可能表明该抑制剂主要通过影响DNA复制应激和炎症反应来发挥作用，而不是直接促进细胞增殖。总的来说，作者巧妙地利用哺乳动物肝脏再生揭示了体内DNA复制起始位点的动态与基因转录之间的关系，并结合衰老模型发现ATR检查点激酶在缓解与复制效率下降相关的炎症中的关键作用。
[学术文献 ] 美国国立卫生院疫苗研究中心通过免疫加感染策略在恒河猴中诱导出强效广谱抗HIV中和反应 进入全文
Cell
2024年10月28日，美国国立卫生院（National Institutes of Health, NIH）疫苗研究中心（Vaccine Research Center, VRC）的John R. Mascola实验室和Peter D. Kwong实验室联合在Cell上发表了题为Potent and broad HIV-1 neutralization in fusion peptide-primed SHIV-infected macaques的文章。该研究利用猴-人嵌合免疫缺陷病毒 (Simian-human immunodeficiency virus, SHIV）感染已经过FP初次免疫和Env三聚体蛋白加强免疫的恒河猴，旨在模拟HIV自然感染，对FP和Env免疫诱导的并可以产生中和抗体的记忆性B淋巴细胞（Memory B cells）进行饱和刺激，探索疫苗诱导的记忆性B淋巴细胞是否有能力在机体内产生足够数量和高质量的抗HIV广谱中和抗体，以达到有效疫苗所需的高血清滴度的广谱抗HIV中和活性，为有效HIV疫苗的研发提供指导。首先，研究者对10只恒河猴进行6次FP初次免疫，并利用两种Env trimer (BG505 and ConC) 进行6次加强免疫。通过血浆FP竞争中和实验，研究者证明在其中4只恒河猴中诱导出了明显的针对FP区域的中和抗体，其体内具有疫苗诱导产生的针对FP的记忆性B淋巴细胞。接着，研究者对这10只恒河猴进行SHIV接种。感染仅8周后，在19株HIV-1假病毒组中有FP中和反应的4只恒河猴的血浆中和活性大幅提升。为了更好的检测血浆中和强度和广谱度，研究者选取每只恒河猴在SHIV感染后的中和活性峰值点血浆，在包含多种亚型的208株HIV-1假病毒组中进行全面系统的中和活性鉴定。结果显示，具有之前疫苗诱导产生的针对FP中和反应的4只恒河猴，其血浆中和广谱度（50%抑制稀释度大于20; ID50>20）在208株检测假病毒组中可达45%至77%，并且几何平均血浆中和滴度（Geometric mean ID50）约为100；而对之前疫苗免疫未有高效应答的6只恒河猴，其血浆中和广谱度仅为4%至29%。然后，研究者对血浆中和数据进行中和指纹辨识（Neutralization fingerprinting）分析，结果显示SHIV感染后大幅提升的血浆中和活性极有可能是针对FP区域的。此外，在SHIV感染后的多个时间点，研究者对恒河猴血浆中的SHIV病毒RNA进行单基因测序，发现在感染后16周时，有6只恒河猴（包括全部4只产生强效广谱中和反应的恒河猴）体内的病毒RNA在Env的FP区域出现明显的逃逸突变，说明体内针对FP区域的广谱中和抗体对SHIV病毒造成了强大的免疫筛选压力。其次，研究者通过单个B淋巴细胞分选（Single B cell-sorting）和抗体克隆技术，利用FP和Env trimer作为钓饵蛋白（Probe）从全部4只高反应恒河猴的中和峰值时间点的外周血淋巴细胞（Peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)中，分离针对FP和其他表位的单克隆抗体（Monoclonal antibodies, mAbs）。研究者从每只恒河猴中分离到约77至103个单克隆抗体，根据其基因序列相似度可划分为约8至24个抗体系（Antibody lineages），其中大部分是针对FP区域的中和抗体。通过在19株HIV-1假病毒组的中和活性检测，研究者在这4只恒河猴中共发现16个具有跨亚型交叉中和反应活性的抗体系。研究团队选取其中6个抗体系中的代表单克隆抗体，在包含多种亚型的208株HIV-1假病毒组中进行全面中和活性鉴定，结果显示中和广谱度（50%抑制浓度小于50μg/mL; IC50<50μg/mL）为34%至58%，其中一个强效抗体（TRNM-b.01）的几何平均抑制浓度（Geometric mean IC50）高达0.43μg/mL，与从HIV-1自然感染者中分离的VRC34.01抗体相当（0.38μg/mL）。接着，研究者通过对血浆中和活性和对应分离的单克隆抗体中和活性进行相关性分析，利用数学模型推测在每只恒河猴血浆内的不同单克隆抗体的浓度，并且按照推测数据利用每只恒河猴中分离的多种单克隆抗体来制作模拟“血浆”。通过对模拟“血浆”的中和活性检测，研究者发现其与真实血浆中和数据高度相关，相关系数（r2）为0.72至0.99，证明血浆中的强效广谱中和反应主要是由分离的广谱中和抗体引起的。再次，研究团队在SHIV感染前后的多个时间点，进行抗原特异性单个B淋巴细胞抗体基因测序，对以上16个具有交叉中和反应活性的抗体系进行追踪和抗体亲和成熟路径分析。结果显示，绝大多数具有交叉中和反应活性的抗体系起源于SHIV感染之前，是由FP和Env trimer免疫诱导引发的。并且，相较SHIV感染前，这些抗体系基因的体细胞突变（Somatic hypermutation， SHM）频率在SHIV感染后明显提升。SHIV感染后，其中两只恒河猴的广谱中和抗体系进行了高度扩增，并显示出巨大差异，其在同一抗体系内的可变区氨基酸序列差异高达25%和30%。此外，通过抗体纵向系统发育分析，研究者发现同一恒河猴内的多个具有交叉中和反应活性的抗体系可能起源于早期同一抗体系。因此，在每只具有高中和反应的恒河猴中，很可能仅有1-2个由疫苗引发的针对FP区域的广谱中和抗体系引发了血浆中的强效广谱抗HIV反应。最后，研究团队从16个具有交叉中和反应活性的抗体系中挑选各自的代表抗体，解析其与HIV-1 Env trimer复合物的冷冻电镜结构，来进一步研究这些抗体的精确结合表位、作用方式和中和机制。研究者共得到13个抗体与Env trimer复合物的高分辨率冷冻电镜结构，并发现其中10个抗体主要结合FP区域的氨基端，2个抗体主要结合FP邻近区域的N88糖基化位点，1个抗体主要结合CD4结合位点。令人振奋的是，FP区域的氨基端和邻近区域的N88糖基化位点均为此疫苗设计模板抗体VRC34.01的主要结合位点。研究者通过对这些冷冻电镜结构的分析和对比，发现在3只恒河猴体内针对FP区域的抗体系与之前团队报道的DFPH-a抗体系属于同一抗体家族，证明诱导这一针对FP区域的广谱中和抗体系并非偶发，可在多个实验动物体内重现。综上所述，本研究采用了一种非常规的手段（SHIV 感染）对记忆性B淋巴细胞进行饱和刺激，并在血清/血浆水平得到强效广谱抗HIV中和反应。虽然难以直接将SHIV感染加入疫苗免疫策略，但是通过此方法证明了HIV免疫原诱导的记忆性B淋巴细胞有能力提供足够数量或高质量的广谱中和抗体，进而在血清/血浆水平上提供有效HIV疫苗所需的强效广谱抗HIV中和反应，进一步验证了针对FP区域的HIV表位疫苗设计策略。下一步，研究团队将着重研究SHIV感染在体内诱发强效广谱抗HIV中和反应的详细机制，并希望在疫苗免疫策略中通过调整免疫佐剂、接种方式和采用复制型蛋白表达病毒载体等来“模拟”SHIV 感染，推动HIV疫苗的研发。
[学术文献 ] 西湖大学研究介绍单细胞谱系追踪数据库scLTdb 进入全文
Nucleic Acids Research
2024年10月29日，西湖大学裴唯珂，张延晓共同通讯在Nucleic Acids Research 在线发表题为“scLTdb: a comprehensive single-cell lineage tracing database”的研究论文，该研究介绍单细胞谱系追踪数据库（scLTdb，https://scltdb.com)包含109个数据集，这些数据集是通过标准管道手动策划和分析的。scLTdb提供交互式分析模块，用于可视化和重新分析scLT数据集，特别是综合细胞命运分析和谱系关系分析。重要的是，scLTdb还允许用户识别与命运相关的基因特征。总之，scLTdb为scLT数据探索和分析提供了一个交互式界面，将有助于理解细胞命运决定和发育及疾病中的细胞系定型。
