法国图卢兹大学开发ALFA标记技术实现植物膜蛋白超分辨率成像

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关键词：

来源：

MPlant植物科学

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资源所属：

农业生物技术专题

类型：

前沿资讯

语种：

中文

原文发布日期：

2025-07-14

摘要：

近日，法国图卢兹大学Julie Neveu和Grégory Vert团队在Plant Communications发表题为“Broad application of the ALFA tagging technology for in planta nanobody-based imaging and biochemical characterization of plant proteins”的研究论文。该技术通过结合ALFA标签和ALFA纳米抗体（ALFA NB），实现了对植物蛋白质的高效检测、定位及功能分析，为植物生物学研究提供了全新的工具。研究人员首先构建了多种表达ALFA纳米抗体（ALFA NB）与不同荧光蛋白（如mCitrine、mScarlet等）融合体的拟南芥转基因株系。这些株系在植物的根尖、叶片和保卫细胞等多种组织中均表现出稳定的荧光信号，且不影响植物的正常生长发育。通过共聚焦显微镜观察，ALFA NB-荧光蛋白融合体在细胞质和细胞核中均匀分布。为了验证ALFA NB-荧光蛋白系统在蛋白质定位中的适用性，研究人员测试了多种亚细胞标记蛋白。例如，当ALFA NB-mCitrine与质膜标记蛋白Lit6b-ALFA共表达时，荧光信号特异性地定位在质膜上，并与FM4-64染料共定位。此外，微管结合蛋白MAP4和线粒体外膜蛋白OM64的ALFA标记版本也能被ALFA NB-荧光蛋白准确检测。然而，ALFA NB无法识别位于线粒体内膜或内质网腔的标记蛋白，表明其应用范围受限于标记蛋白的亚细胞定位。研究人员以拟南芥铁转运蛋白IRT1为例，展示了ALFA技术在难标记蛋白质研究中的优势。IRT1是一种疏水性跨膜蛋白，传统标记方法常影响其功能。通过将ALFA标签插入IRT1的特定胞质环中，研究人员成功获得了功能性融合蛋白，并通过ALFA NB-mCit实现了IRT1的活体成像。此外，研究还发现，金属过量会触发IRT1的内吞和液泡靶向。通过三分子荧光互补（TriFC）实验，研究人员成功检测到IRT1与已知互作蛋白（如AHA2和FRO2）的相互作用。此外，通过将ALFA NB与E3泛素连接酶RING结构域融合，研究团队实现了对IRT1-ALFA的靶向降解，为蛋白质功能调控提供了新工具。研究人员还利用ALFA标签和光转换荧光蛋白mEos3.2，实现了单粒子追踪光激活定位显微镜（sptPALM）对质膜蛋白Lit6b和IRT1的超分辨率成像。结果显示，IRT1的扩散行为与已知的质膜蛋白一致，进一步验证了ALFA标签技术的可靠性。综上所述，本研究通过构建ALFA标签-纳米抗体植物工具箱，系统验证了其在亚细胞定位、蛋白质互作、靶向降解及超分辨成像等领域的卓越性能，特别突破了IRT1等难标记蛋白的研究瓶颈，为植物蛋白功能研究提供了前所未有的灵活性，尤其适用于传统方法难以处理的蛋白。