北京大学开发PRESENT同义突变筛选方法

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关键词：

来源：

Nature Biotechnology

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来源地址：

https://www.nature.com/articles/s41587-025-02710-z

资源所属：

农业生物技术专题

类型：

学术文献

语种：

英语

原文发布日期：

2025-06-24

摘要：

2025年6月24号，来自北京大学的魏文胜教授研究团队在《Nature Biotechnology》上发表题为“Prime editor-based high-throughput screening reveals functional synonymous mutations in human cells”的研究论文。该研究利用PEmax系统创建了一个包含297900个工程化Prime编辑向导RNA的文库，并进行了广泛的筛选，以识别影响细胞适应性的同义突变。同义突变通常被认为是中性的，但它们在人类基因组中的作用尚不清楚。与酵母中的近期发现不同，群体水平分析显示同义突变与非同义突变在适应性效应上存在差异，但相对于阴性对照表现出类似的表型分布。经过严格的质量控制后，只有少数突变显示出可测量的效应。对于这些功能性突变，研究者开发了一种专门的机器学习工具，并揭示了它们对信使RNA剪接和转录等各种生物过程的影响，得到了多方面的实验证据支持。研究发现，同义突变可以改变RNA折叠并影响翻译，如PLK1_S2所示。通过将筛选数据与模型整合，研究者预测了具有临床有害性的同义突变。这项研究加深了我们对同义突变的理解，为临床疾病研究提供了见解。研究团队开发了一种名为PRESENT（Prime editor-based screen technology）的同义突变筛选方法，使用PE技术创建了针对3644个人类蛋白编码基因的epegRNA文库，以筛选可能影响人类细胞适应性的功能性同义突变。研究结果证实，尽管人类基因组中的大多数同义突变可能是中性的，但少数可以产生表型变化。通过机器学习，研究者识别了这些突变如何影响一系列生物过程，包括信使RNA剪接、折叠、转录和翻译，并预测了具有临床有害性的同义突变，从而增强了我们对这些突变及其在人类疾病临床研究中的重要性的理解。为了精确且高效地在不同类型的核苷酸替换中产生同义突变，研究团队使用PEmax系统以及epegRNA进行靶向遗传编辑。为了便于高通量筛选，研究者在epegRNA的外部区域整合了条形码，称为eBARs。每个epegRNA都被标记了三个独立的eBARs，有效地为筛选过程创建了三个生物学重复。研究团队选择了人类结肠癌细胞系HCT116作为筛选对象，因为该细胞系由于MLH1基因的自然纯合无义突变而有利于PE编辑。经过一系列特定标准筛选后，研究团队构建了一个epegRNA文库。该文库最初从两个人类疾病数据库ClinVar和SynMICdb中获取潜在的致病性同义突变。此外，研究团队还选择了67个基因进行饱和同义突变设计，这些基因基于它们的突变负荷和表达水平，包括之前在酵母中研究过的人类同源基因。在这组基因中，11个必需人类基因被选为饱和拼接突变设计，以彻底评估同义突变的生物学影响。文库还设计了用于基因敲除的单碱基插入或提前终止密码子的引入，并包含了AAVS1靶向和非靶向epegRNAs作为阴性对照。每个突变位点平均被2.2个epegRNAs靶向。对于11个饱和突变设计的基因，涵盖了点突变范围内的所有可能类型的氨基酸替换。最终，文库包含297900个epegRNAs，针对3644个蛋白编码基因的94993个同义突变和39336个非同义突变。通过慢病毒转导将PEmax稳定整合到HCT116细胞中，并选择单克隆用于后续研究。HCT116-PEmax细胞的表达谱与野生型（WT）细胞几乎相同，且感染了非靶向或AAVS1靶向epegRNAs的HCT116-PEmax细胞作为阴性对照，显示出最小的变化。这表明稳定细胞系与WT HCT116细胞的特性非常相似。研究团队还评估了PEmax在HCT116细胞中的编辑效率。在28天的培养期内，每隔一段时间取样，高效率的FANCF+5 G-to-T突变的编辑在14天后逐渐减缓，而低效率的RNF2+1 C-to-A突变的编辑效率随时间逐渐增加。鉴于表型变化通常滞后于基因型变化，研究团队将筛选时间延长至35天。