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[前沿资讯 ] 中科院天津工业生物技术研究所基于AI从头设计人工细胞色素P450酶 进入全文
ScienceAAA
近日，中国科学院天津工业生物技术研究所的江会锋团队在Research杂志上发表题为“Cytochrome P450 Enzyme Design by Constraining Catalytic Pocket in Diffusion Model”文章，通过揭示自然界细胞色素P450酶新功能进化原理，首次创建了一种基于扩散模型的新酶设计方法，能够精准的设计出具有指定功能的P450酶序列，成功率约60%。本研究以合成心脑血管疾病特效药灯盏乙素的关键P450酶（黄酮6位羟化酶：F6H）为例，首先通过进化分析揭示了黄酮6位羟化功能起源机制，其祖先序列通过催化口袋的残基重塑进化出了全新的黄酮6位羟化功能。然后，研究人员通过渐进式回复和积累突变的方法，从F6H催化口袋的48个残基中鉴定出5个创始残基，并证实了它们在催化功能产生过程的“创始”作用，详细阐明了P450酶功能创新的分子机制。随后，研究人员利用P450口袋设计原则，结合深度学习扩散模型，开发出了P450Diffusion模型。该模型首先通过对20多万P450酶序列进行预训练学习，然后使用增强采样对预训练模型进行微调，从头生成了全新的P450蛋白。最后，研究团队利用P450Diffusion生成了60,000个非天然P450酶序列，并从中虚拟筛选出17条序列进行实验评估。结果显示，17个设计中有10个表现出显著的F6H活性，其中6个设计的催化能力优于天然的F6H，活性最高提升3.5倍，显示出该模型在P450酶从头设计中的巨大潜力。这项研究结合P450酶的海量序列数据以及自然界P450酶的口袋设计原则，利用深度学习扩散模型为P450酶从头设计提供了新思路。下一步，针对任意底物可以通过过渡态分析设计其相互作用的氨基酸，然后从头生成具有特定催化功能的新P450酶。这一方法有望在生物工程和工业催化等领域发挥重要作用，大力推进新酶的开发和应用。
[前沿资讯 ] 上海交通大学建立基因编辑超快速检测植物内源蛋白技术 进入全文
iPlants
近日，上海交通大学陆钰明教授课题组联合南方科技大学朱健康院士团队，在Plant Communications在线发表了题为“Rapid and dynamic detection of endogenous proteins through in-locus tagging in rice”的研究论文。该研究将新型荧光素酶系统与基因敲入技术结合，在植物上建立了一种无需抗体、超快速、高通量地动态检测植物内源蛋白的新技术——TagBIT。利用该团队前期开发的高效片段敲入技术（TR-HDR），TagBIT系统将只有11个氨基酸的新型蛋白标签HiBiT原位敲入至目标蛋白的N/C端（原位标签，In-locus tagging）；然后利用筛选得到新型荧光素底物“Fluorofurimazine”开发了适用于植物的荧光素酶反应体系。对10+个水稻内源蛋白进行的实时追踪实验表明，TagBIT可实现各种类型的蛋白研究，对内源蛋白实现：（1）超快速的Western blot（无需抗体）；（2）像GUS/GFP一样的原位发光成像；（3）像Luciferase一样的酶动力学动态追踪；（4）像Flag一样的高效的co-IP和质谱检测互作蛋白。值得注意的是，TagBIT技术通过原位标签，绕开了传统的基因克隆和载体构建限制，首次实现了对水稻超大基因TOR（~26k）的动态检测和蛋白互作研究。研究团队首先设计了一个用于N端标记的通用的供体DNA序列，并选择了3个候选基因：MDH2、TT1和SLR1。在使用商业HiBiT蛋白检测试剂盒的初步试验中，他们遇到了信号强度低和稳定性有限等问题，这对于TT1和SLR1等大量中低丰度蛋白的检测构成了挑战。HiBiT系统由Promega公司开发并商业化应用，其检测灵敏度已经非常高，要在该基础上进一步提升检测效率非常困难。研究团队通过大量研究，另辟蹊径地筛选采用了一种新型荧光素底物——Fluorofurimazine；并根据植物组织的特点系统性优化了整个酶促反应体系。最终的检测结果表明，系列优化使该超高灵敏度检测系统又进一步大幅提升了近7倍。这一重大改进，使植物上大量的低丰度内源蛋白的检测成为可能。利用TagBIT系统，研究团队首先发展了超快速的Western Blot体系。由于该技术无需抗体，可转膜后直接显影（无需反复洗涤和抗体孵育），极大地简化了整个免疫印迹过程。动态检测应用上，研究人员成功实现了对赤霉素信号通路中关键蛋白SLR1丰度的动态追踪。尽管赤霉素GA3刺激SLR1的mRNA水平上升，但TagBIT酶促分析显示蛋白水平在40分钟内急剧下降61.6%，揭示了mRNA与蛋白质丰度不一致的现象。这项技术为实时监测植物蛋白丰度提供了有效手段。研究内源蛋白的时空分布对于理解其功能至关重要。传统的免疫化学染色技术依赖于特异性抗体进行空间检测，在植物中常常面临挑战；而基于转基因的（GFP标记）检测方法由于其异位效应，往往不能准确反应内源蛋白的真实时空分布。HiBiT标签因其发光特性，在哺乳动物研究中显示出用于原位蛋白可视化的潜力，但需要另一配体蛋白LgBiT，因此植物上尚无相关研究。为了解决这一问题，研究团队构建了表达LgBiT的转基因系（LgBiT-OE）并得到了稳定的T1代后代。为了测试这种方法，他们以水稻中具有根特异性表达的基因Lsi2为目标蛋白，构建了Lsi2-TagBIT原位标签株系。将其与LgBiT-OE杂交后，对F1代幼苗（Lsi2-TagBIT×LgBiT-OE）进行了原位生物发光检测。将F1代幼苗浸入Fluorofurimazine溶液中，并用冷冻CCD相机成像，揭示了Lsi2在根部的特定定位，证实了该方法的有效性。这种通用的杂交策略实现了植物蛋白的有效原位可视化，并为阐明植物内源蛋白分布提供了一种多功能工具。研究团队进一步探究了TagBIT技术在检测植物内源蛋白-蛋白互作（PPIs）方面的应用潜力。尽管HiBiT和LgBiT具有出强烈的相互作用，但其实验表明单独的LgBiT并未能有效沉淀目标蛋白，这表明此类应用需要额外的相互作用强度。因此，他们采用抗HiBiT抗体进行co-IP实验，以检测内源TagBIT蛋白及其互作蛋白。他们选择了雷帕霉素靶蛋白（TOR）基因作为研究对象，该基因对于能量代谢、作物产量、抗病性和耐逆性至关重要，并且由于其庞大的基因长度（约26kb），研究起来颇具挑战。研究团队通过原位标签，成功获得TagBIT-TOR基因编辑植株。接着，在T3代幼苗上使用HiBiT抗体进行了co-IP实验。通过质谱分析共沉淀产物，揭示了772个潜在互作蛋白，证实了TagBIT系统的有效性。这项研究首次为水稻内源TOR的蛋白质相互作用网络提供了基础信息，表明TagBIT技术是阐明大型基因编码的内源蛋白之间互作的可行方法。
[前沿资讯 ] 北京理工大学基于迁移学习生成物种特异性启动子方面取得进展 进入全文
科微学术
近日，北京理工大学霍毅欣教授与郭淑元教授团队在Nucleic Acids Research发表论文，题为“Species-specific design of artificial promoters by transfer-learning based generative deep-learning model”。该工作在物种数据集较少的条件下，训练了较高质量的生成模型PromoGen，用于从头生成物种特异性启动子。启动子是在转录水平上调节基因表达的关键元件，能够启动基因转录、调节基因表达，并影响代谢途径中的代谢流分布。尽管天然启动子已被用于基因调控，但其缺乏连续的调控强度和广泛的调控范围。目前，深度学习在蛋白质设计、调控元件生成等领域已经取得了一定的进展，但是在数据集缺乏的条件下还不能生成质量较高的调控元件。为了解决原核生物启动子数据量不足的问题，团队基于迁移学习的策略，开发了一系列核苷酸语言模型 PromoGen，用于在数据缺乏的条件下从头生成物种特异性的启动子。通过位置权重矩阵、6聚体频率相关性和 -10 区域分布分别对枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)的PromoGen-bsu模型生成启动子的能力进行分析。并对PromoGen-bsu生成的启动子进行湿实验验证，结果表明72.7%的生成启动子的启动活性高于天然启动子PlepA的3倍，18%的启动子与天然强启动子活性水平相当。为了证明迁移学习策略的有效性，分别使用27个物种的启动子的数据，在PromoGen-pre上对其进行微调，得到了27个物种的生成模型。并对所有的模型进行预训练和微调性能评估，微调后32%的模型相关性超过0.8。此外，团队开发了一个在线平台（https://promogen1.cloudmol.org/），该平台针对27种原核生物提供了微调后模型来从头生成启动子。
[前沿资讯 ] 勃艮第大学综述植物与微生物相互作用中的多效性作用因子 进入全文
Ad植物微生物
近日，法国达鲁瓦勃艮第大学农业科学研究院农业研究所Patricia Gerbeau-Pissot和Françoise Simon-Plas在TRENDS IN PLANT SCIENCE上发表了一篇题为“Sterols, pleiotropic players in plant–microbe interactions”的综述文章。笔者介绍了植物甾醇多样性受 PMI 调节、植物甾醇冻结或移动，植物甾醇参与 PMI 诱导的 PM 空间重组和功能，以及甾醇作为警告信号和沟通因素在区分敌友，分子串扰中发挥的作用。PMI是复杂且动态的过程，植物与有益或病原微生物相互作用。互利共生改善了伴侣双方的健康，特别是通过营养交换，而发病机制会导致定植植物患病，除非在不相容的相互作用中，其中微生物的生长因植物防御反应而停止。在 PMI 中，两个合作伙伴共享一个特定的接口，在交互发挥作用之前首先确定兼容性。植物-微生物界面包括 PM 蛋白、细胞壁 (CW) 蛋白和多糖的胞外结构域，以及质外体化合物。微生物发育所必需的营养物和/或脂质要么分泌到质外体，要么通过多种机制直接从宿主植物转移到微生物。笔者指出与仅积累最终甾醇产物（分别是胆固醇和麦角甾醇）的动物和酵母细胞不同，植物甾醇生物合成途径的不同最终产物和许多中间化合物的混合物共存于植物中，导致最终植物甾醇成分多样化。甾醇含量的变化是对环境条件的反应。甾醇介导的PM生物物理特性在PMI期间受到调节。甾醇，特别是它们的游离形式，在 PM 处积聚，其中它们的横向区划通过有组织的结构域形成来解释PM的专业化。甾醇的平面环状结构有利于它们插入脂质双层，在那里它们调节脂肪酰基链的流动性并有助于形成结构域，其中包括液体有序相。每种甾醇对膜特性的影响不同，具体取决于其侧链上是否存在甲基或乙基。与胆固醇相比，这使得植物甾醇在排列脂质双层方面的效果较差，并且乙基通过增加烷基尾部的体积并导致不完美的堆积来放大这种效果。有序能力随着 C22 处的双键以及烷基尾部的增大和双层中的溶解度降低而降低。引人注目的是，豆甾醇/β-谷甾醇比率根据 PMI增加或减少。然而，拟南芥 Atcyp710A1 无效突变体显示出非宿主和基础抗性受损，而AtCYP710A1的过度表达增强了对宿主病原体的抗性，表明甾醇组成与 PMI 结果之间存在联系。在感染黄萎病的棉花中，GhCYP710A1的沉默导致豆甾醇产量减少。遗传方法使我们提出了一种将甾醇整合到 PM 介导的PMI结果中的机制模型。甾醇还参与PMI诱导的PM空间重组和功能。在PMI期间，植物PM的深度重塑对于后续的适应性响应至关重要。事实上，微共生体的进入和发育需要形成 PM突起。甾醇科作为警告信号和沟通因素。导致抗病性的一种机制是植物细胞区分自身和非自身的能力。麦角甾醇是一种真菌甾醇，经常被视为外来分子这些反应包括特征性激发子诱导的反应，支持麦角甾醇作为 病原关联分子模式PAMP。外源应用豆甾醇和β-谷甾醇分别诱导真菌和植物细胞生长，表明来自PM外部的甾醇激活导致细胞变化的信号级联。对参与 PMI并被共同进化过程靶向的多种甾醇结合蛋白的研究，以及对来自麦角甾醇不是唯一的真菌甾醇，而且它在真菌中的存在量不同。为了充分了解甾醇在PMI中的作用，特别是在信号传导途径和营养交换的调节中，有必要更好地表征微生物 PM 中的甾醇生物合成和甾醇混合物的调节。甾醇类参与PM组织的调节、细胞内膜和PM之间的膜交换方向的诱导调节、甾醇结合蛋白的激活和抗菌等许多细胞功能，并且PMI中这些细胞事件之间的联系仍不清楚。根据目前的理解，甾醇的多效性作用使得很难清楚地描述它们在 PMI 结果中的具体作用。植物甾醇的生物发生、功能、贡献和微调调节因参与相互作用的植物和微生物而异。此外，目前还没有办法确定哪种伙伴（植物或微生物）诱导了在受攻击细胞中观察到的基因重编程。解决这个问题的一种方法可能是通过关注 PMI 领域来研究基因表达的调控，以获得有关合作伙伴之间广泛而具体的重新规划的更多信息。此外，迄今为止研究很少的遗传方法，包括产生针对参与甾醇生物合成的基因的条件和/或组织特异性突变体，可能是一个有前途的研究途径。这些策略还应有助于破译每种甾醇调节细胞信号传导的不同能力如何在不同的 PMI 中发挥作用，同时避免甾醇介导的对植物发育的非特异性影响。另一个挑战是追踪细胞内甾醇的旅程以及它们在伙伴之间可能的转移。还必须探索甾醇动力学的剩余未解机制，特别是使用与甾醇传感器（仍有待优化）表达耦合的高分辨率显微镜。
[前沿资讯 ] 天津农科院通过基因组分析揭示花椰菜凝乳生物发生的逐步驯化及遗传机制 进入全文
Science Art
近日，天津农科院孙德岭/中国农大林涛团队在Nature Genetics上发表题为：“Genomic analyses reveal the stepwise domestication and genetic mechanism of curd biogenesis in cauliflower”的研究论文。研究者更新了花椰菜C-8 (V2)的高质量参考基因组组装，并通过整合PacBio SMRT测序、Bionano光学图谱和Hi-C技术，辅以Illumina全基因组鸟枪法数据，得到了一个高连续性的基因组序列。通过对971个不同品种的花椰菜及其近亲的全基因组重测序，研究者构建了一个全面的基因组变异图谱，检测到大量单核苷酸多态性（SNPs）和插入/缺失（InDels）。通过构建最大似然（ML）树，研究者探索了不同B. oleracea亚种之间的系统发育关系，确认了中国芥菜（clade 1）、甘蓝型蔬菜（clade 2）、西兰花（clade 3）和花椰菜（clade 4）作为主要的分支。花椰菜的驯化历史较短，大约2500年。研究者根据植物架构和成熟度将726个花椰菜品种分为五组，揭示了从西兰花到花椰菜的逐步驯化路径。研究者通过群体基因组分析，鉴定了与花椰菜花球形成相关的基因，特别是三个MADS-box基因CAL1、CAL2和FUL2，它们在花球形成中可能起着关键作用。研究者测量了七个重要的农艺性状，并使用GWAS方法鉴定了与这些性状显著相关的基因座和候选基因，包括控制花椰菜茎高（SH）的锌指蛋白基因BOB06G135460。研究中使用的种子材料、基因组数据和相关分析工具已经公布或存储在公共数据库中，以供进一步研究使用。这项研究为理解花椰菜的遗传基础、花球形成机制以及农艺性状的分子基础提供了宝贵的资源，为未来的种质创新和花椰菜品种改良奠定了基础。
[前沿资讯 ] 苏黎世联邦理工学院开发新方法评估微生物组动态 进入全文
Ad植物微生物
近日，瑞士苏黎世联邦理工学院微生物研究所 Vorholt 实验室（近两年在Science等顶刊发表一系列论文）苏黎世联邦理工学院Julia Vorholt院士团队在叶际微生物组领域取得重大进展）、Hardt 实验室和 Sunagawa 实验室联合开发了一种新型基因组条形码系统：WISH-tags。成果发表在Nature Microbiology，论文题为“Assessing microbiome population dynamics using wild-type isogenic standardized hybrid (WISH)-tags”。微生物经常组合成结构化的微生物组，在植物和动物宿主中发挥关键作用。然而，观察到的微生物组组成可能会掩盖多种多样的潜在种群动态，这就需要在菌株内水平上进行解析。在最近这项关于 NCCR 微生物组的合作研究中，来自 Vorholt、Hardt 和 Sunagawa 实验室的研究人员开发了一种新型基因组条形码系统，称为野生型同源标准化杂交（WISH）标签。这些标签可以利用 qPCR 或下一代测序技术对微生物种群进行量化和追踪。研究人员将 WISH 标签引入了小鼠和植物微生物群中的模式和非模式细菌。他们以两种细菌菌株为重点，研究了小鼠肠道和拟南芥叶际中菌株内部的优先效应。奇怪的是，两种宿主的结果却不同。在肠道中，晚到的菌株无法建立新的种群，而在叶际中，即使已有种群存在，晚到的菌株仍能茁壮成长。研究人员通过他们的概念验证应用表明，WISH-tags 是一种宝贵的资源，可用于破译微生物组在不同生物系统中组装的种群动态。了解这些动态有助于设计更稳定的合成微生物群，从而减少疾病，提高一系列宿主物种的适应性。
