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[前沿资讯 ] 哈佛大学开发三代HiFi宏基因组组装软件 进入全文
宏基因组
宏基因组样本的从头组装是研究微生物群落的常用方法。当前针对短读长或错误率高的长读长开发的宏基因组组装软件尚未对组装准确的长读长序列进行优化。因此，我们开发了hifiasm-meta，一种利用近期出现的高精度的宏基因组数据进行宏基因组组装的软件。通过使用七个经验数据集进行评估，hifiasm-meta在每个数据集重建了数十到数百个完整的闭环细菌基因组，始终优于其他宏基因组组装软件。短读长宏基因组组装通常能产生长度为数十千碱基（kbp）的重叠群，约为细菌基因组大小的1%。截至2019年9月，经过多年的宏基因组测序，只有62个完整的细菌基因组从宏基因组样本中组装而成。尽管当前可以使用分箱算法将短的重叠群聚类到宏基因组组装基因组（MAG）中，但是分箱会产生较高的错误率，导致下游分析复杂化或错误。短读长MAG的局限性，激发了metaFlye的开发，唯一已发表的专门用于长读长宏基因组组装的软件。metaFlye是基于Flye开发的，其适用于错误率约10%的嘈杂长读长数据组装，不适用于PacBio产生的高准确度数据组装，并且对于单物种HiFi组装来说是次优的。为了充分利用长而精确的HiFi读长的全部优势，我们开发了hifiasm-meta，将作者早期开发的hifiasm应用到宏基因组样本组装中。与单个物种的组装相比，宏基因组组装带来了几个独特的挑战，例如PacBio HiFi数据中读长长度差异较大，以及某些单倍型的高倍性与低覆盖率相结合。作者在hifiasm-meta中做了几个重大改变来应对这些挑战。首先，hifiasm-meta具有读长选择步骤，可以减少高丰度菌株的覆盖率，而不会丢失低丰度菌株的数据。其次，在组装图的构建过程中，hifiasm-meta试图保护低覆盖率基因组中的序列，这些序列可能被视为嵌合序列并被原始hifiasm丢弃。第三，hifiasm-meta 只有在推断出与读长完全重叠的其他序列来自同一单倍型时，才会丢弃包含的序列，这减少了由内含序列而引起的重叠群断点。第四，在初始图构建之后，hifiasm-meta使用测序深度信息来修剪unitig，假设来自同一菌株的unitigs往往具有相似的覆盖率。它还尝试连接来自不同单倍型的单元，以修补剩余的组装间隙。这些策略使hifiasm-meta在进行高精度宏基因组装时更加健全。作者首先评估了hifiasm-meta (r58-31876a0)，metaFlye (v.2.9) 和 HiCanu (v.2.2) 在两个人工合成菌群，ATCC和zymo（表 1），上的组装性能。ATCC由20个不同的物种组成，其中15个丰度较高，为0.18-18%，5个为稀有物种，丰度为0.02%。hifiasm-meta能够重建13个丰度较高的物种，并且每个物种都能被组装为一个完整的闭环重叠群，可与metaFlye和HiCanu相媲美。三种组装工具都将丰度为18%的牙龈卟啉单胞菌组装成两个重叠群，没有组装工具能够完全重建五个低丰度的物种。作者手动检查了这些低丰度物种的序列对齐文件，发现它们的组装间隙都是由于测序深度不足造成的，目前无法用现有的数据完全组装这些物种。zymo数据集包含17个不同种属的21个菌株，其中包括5个大肠杆菌，每个大肠杆菌的丰度约为8%。该数据集的挑战在于多个近缘物种大肠杆菌的同步出现。hifiasm-meta将菌株B3008组装成一个完整的闭环重叠群，菌株B766组装成两个重叠群，其余为碎片重叠群；HiCanu将B3008和B0组装成完整的闭环重叠群；metaFlye未能将五个菌株组装为闭环重叠群。hifiasm-meta将丰度为0.04%的硫代甲烷短杆菌组装为了更连续的重叠群。总体来说，三种组装软件在两个模拟菌群数据集上都具有相似的准确性。
[前沿资讯 ] 塞恩斯伯里实验室揭示大麦免疫受体赋予对稻瘟病菌抗性 进入全文
Ad植物微生物
植物核苷酸结合富含亮氨酸重复免疫受体（NLRs）直接或间接识别病原体分泌的效应蛋白，以启动植物防御。单一NLR识别多种病原体是罕见的，通常通过监测宿主蛋白的变化来实现；很少有特征性的NLR被证明能识别多种效应蛋白。大麦NLR基因Mla经历了功能多样化，由不同Mla等位基因编码的蛋白识别大麦白粉病的宿主适应分离株。2023年10月11日，权威期刊The Plant Cell 在线发表了英国塞恩斯伯里实验室Matthew Moscou团队的研究成果，题为Barley MLA3 recognizes the host-specificity effector Pwl2 from Magnaporthe oryzae的研究论文。在这里，科研人员研究了Mla3如何以剂量依赖的方式赋予对稻瘟病菌的抗性。使用正向遗传筛选，科研人员发现来自稻瘟病菌的效应蛋白对Pwl2致病，这是一种防止稻瘟病菌感染弯叶画眉草的宿主范围决定因素。因此，Mla3逐渐进化出从不同病原体中识别效应蛋白的能力。大多数NLR以病原体物种或分离株特异性的方式赋予抗性。Mla等位基因已经通过等位基因的功能差异很好地研究了分离株对Bgh的特异性抗性。然而，尽管对多种病原体的抗性已经被定位到大麦单倍型的Mla基因座，但由于跨基因座的抑制重组的局限性以及不能用当前的基因组工具组装该区域，许多潜在的致病基因尚未被鉴定。Mla的同源基因，普通小麦中的Sr33和黑麦中的Sr50，赋予了对茎锈病病原体的抗病性。Mla、Sr33和Sr50强调了直系同源基因进化出新的和不同的病原体特异性的潜力，扩大了对子囊菌和担子菌病原体多样性的Mla基因家族的识别范围。相比之下，Mla8显示出对Bgh和锈菌都具有抗性。科研人员证实了大麦NLR MLA3识别来自稻瘟病菌的效应蛋白Pwl2，并表明这种单一NLR能够识别两种分类上不同的病原体。MLA3特异性识别宿主特异性决定簇Pwl2，这种效应蛋白的缺失使得稻瘟病菌成功感染，并且MLA3和Pwl2在本氏烟草中的短暂共表达触发了强烈的超敏反应。因此，Mla3进化出从Bgh识别宿主适应的效应蛋白的能力，并从稻瘟病菌收敛识别重要的宿主决定效应蛋白，进一步扩展了Mla基因座的多病原体识别。最近，发现稻瘟病菌小麦致病型的出现是由于PWT3和PWT4编码的特异性效应蛋白的连续丢失。相应的小麦R基因Rwt3和Rwt4负责感染期间稻瘟病菌的不亲和性，它们的分离促进了稻瘟病菌逐步适应成为小麦的病原体。对PWL致病性多基因家族的成员Pwl1、PWL2、PWL3和PWL4有助于稻瘟病菌致病型的宿主特化。首先在水稻分离株中鉴定的PWL2防止了对弯叶画眉草的感染，因此调节了宿主特异性。Pwl2效应蛋白中的小氨基酸变化可以导致毒力产生，然而Pwl2在不同地理位置的群体中表现出低遗传变异，并且大多数对水稻致病的分离株含有Pwl2。水稻中PWL2抗性基因的缺乏将促进PWL2在水稻感染谱系中的广泛流行。到目前为止，在画眉草中识别PWL2的抗性基因还没有被鉴定，并且在该草种中识别的潜在机制仍然未知。画眉草中缺乏明确的Mla直向同源基因和MLA3对Pwl2的特异性识别，以及Pwl2识别的保守特异性强烈表明画眉草中MLA3和未知抗性基因趋同进化为Pwl2识别。在这里，科研人员表明，在本氏烟草中，Pwl2识别是在与MLA3特异性相关时触发的。这种相互作用足够强和稳定，可以在免疫共沉淀试验中检测到，这在其他MLA-AVRA对应对中没有显示出来。尽管不同的MLA等位基因直接识别Bgh AVRa效应蛋白，但这些蛋白质-蛋白质相互作用可能是短暂的，因此无法通过蛋白质pull-down实验检测到。然而，在本式烟草异源系统中，MLA3和Pwl2之间的相互作用是清晰和强有力的。考虑到支持不同MLA等位基因直接识别Bgh AVRa效应蛋白的证据，MLA的进化轨迹，以及本氏烟草和大麦之间的系统发育距离，MLA3直接识别Pwl2仍然是最简约的识别模型。序列相似的Mla等位基因如何识别来自不同病原体物种的结构不同的效应蛋白的问题仍然存在。文献报道的NLRs识别多种病原的案例并不多见，迄今为止研究的所有实例都涉及在作为守卫者或诱饵的共享宿主靶标上或在NLRs的集成结构域上感知保守的效应子活性。TIR-NLR ROQ1分别直接识别来自丁香假单胞菌( P. syringae )、黄单胞菌( Xanthomonas spp . )和青枯菌( Ralstonia spp . )的效应蛋白HopQ1、XopQ和RipB。但是这三个效应子都是同源的，并且可能具有几乎相同的结构。Pwl2和AVRa3可能属于具有不同结构折叠的效应子家族，表明MLA3进化为直接识别两个结构不同的效应子。一旦确定Pwl2和AVRa3的结构和结合界面将为阐明识别的分子机制提供第一步。尽管AVRa3和Pwl2具有不同的整体结构， 但由于共享的结构特征而被MLA3直接识别。这可能代表了在分类不同的物种中保守的病原体效应蛋白的结构特征，并可能指导效应蛋白发现和NLR工程走向扩大识别和抗性。
[前沿资讯 ] 华威大学构建拟南芥多细胞器官设计 进入全文
MPlant植物科学
2023年10月11日，来自英国华威大学的研究团队在Curret Biology上发表了题为“A quantitative morphospace of multicellular organ design in the plant Arabidopsis”的研究论文，考察了细胞组织的特性能否作为细胞嵌入空间的新兴特性而“自由”产生，而非由模式化过程主动产生。研究建立了一个定量形态空间，有助于了解器官构建的原理及其在单个生物体中的多样性。研究人员使用三维（3D）数字组织模型建立了默认的细胞构型。通过对这些合成细胞组合进行基于网络的分析，确定了细胞组织的定量拓扑基线，该基线通过被动空间堆积和网格组织中自由产生的最小秩序而获得。随后，他们为模式植物拟南芥生成了三维细胞分辨率数字组织图谱，并通过与数字组织模型进行统计比较，确定了该生物体器官在多大程度上符合默认构型。拟南芥不同组织中的细胞不符合随机堆积排列，且这些不符合的程度有所不同。最接近随机模型的是未分化的嫩枝顶端分生组织（SAM），气生器官就是从该组织中产生的。研究人员利用定量拓扑形态空间研究了拟南芥器官中细胞组织之间的定量关系，其中使用的全局细胞连接性的连接体由两个维度组成：局部效率和全局效率。不同拟南芥组织的归一化全局效率相对恒定，表明它们对这种规模的信息传递是稳健的。通过随机质心定位模型、有序质心格噪声扰动、质心偏置定位三种模型，研究人员探索了嵌入3D空间细胞的拓扑景观。叶片和萼片组织与基线的偏差最大，表明它们是拟南芥中最“复杂”的组织。对造成这些组织和默认模式之间差距的模式原理进行研究，发现了细胞伸长和空气空间的引入增加了器官模式复杂性。总之，这项研究生成了3D数字组织图谱，为探索拟南芥的组织复杂性和3D细胞形状提供了宝贵的资源。在代表性数据集中进行的细胞类型注释有助于细胞类型特异性分析。这些数据可以用作3D模板来运行不同器官中运输和生长过程的各种模拟。
[前沿资讯 ] 德国马普所证实核基因组可研究线粒体基因功能 进入全文
MPlant植物科学
近日，Nature Plants在线发表了德国马普分子植物生理研究所Ralph Bock团队及其合作者题为“Targeted knockout of a conserved plant mitochondrial gene by genome editing”的研究论文。该研究通过敲除烟草线粒体呼吸链复合物 I的nad9基因揭示了其在植物发育中的作用，证明了使用核基因组编辑方法研究线粒体基因功能的可行性，为工程化线粒体基因组提供了重要的基础。基于TALE融合蛋白的基因组编辑方法，虽然不允许转基因直接插入到线粒体基因组中，但能够将突变引入线粒体基因组。当TALEN靶向线粒体时，它可以切割线粒体 DNA，从而诱导线粒体基因组的缺失。尽管依赖于 TALEN的碱基编辑方法已被证明能够将特定的点突变引入线粒体 DNA；然而，分离具有同质性突变线粒体基因组的、遗传稳定的植物（称为同质线粒体植物homochondriomic plants），仍然具有挑战性。此外，线粒体碱基编辑器可能会导致核基因组和线粒体基因组中出现大量的脱靶突变；非同源末端连接的缺乏，也会产生复杂的基因组重排。线粒体保守基因nad9是编码了呼吸复合物 I 亚基，即线粒体内膜中的 NADH-泛醌氧化还原酶复合物。利用烟草（Nicotiana tabacum）和TALEN，该研究生成了大量的线粒体 nad9 基因的缺失突变体。除了具有基因组重排的突变体外，研究人员还分离到了携带清洁的、同质线粒体的nad9突变体。进一步分析显示，Δnad9-29株系中线粒体基因组的构象与野生型相似；表明它没有任何线粒体基因组重排，可用于研究nad9敲除的生物学功能。复合物 I 是呼吸链的主要组成部分；它为电子进入呼吸链提供了一个主要入口点，对于许多（但不是全部）生物体都至关重要。该研究发现与野生型相比，nad9 缺失株在营养阶段的生长和发育明显迟缓，叶子更细长，叶缘卷起。当在高光条件下以最大速率生长时，突变体的表型更加严重，并伴有额外的缺陷：包括苍白的叶斑和顶端优势减少（即分枝增加）。尽管这些表型在所有31个缺失株中均有发现，但它们严重程度有所不同。此外，在花朵发育过程中，该研究发现突变株的花瓣形状严重畸变：花冠边缘卷曲，花药退化，以及雄性不育；表明nad9缺失会导致细胞质雄性不育（CMS）。
[前沿资讯 ] 德国马普所揭示内质网调节根际微生物群落聚集机制 进入全文
Ad植物微生物
近日，New phytologist杂志在线发表德国马普所Ryohei Thomas Nakano团队题为 “ ER body-resident myrosinases and tryptophan specialized metabolism modulate root microbiota assembly”的研究论文。植物根际是指植物的根表以及受根系直接影响的土 壤区域，它是植物根系对土壤产生直接、强烈影响的区域，与土壤本身的物理、化学 和生物性质有所不同。这个区域中存在大量与植物相互作用的微生物，被称为根际微 生物。这些微生物在植物的生长和发育以及植物病虫害的生物防治等方面扮演着非常 重要的角色。内质网体(Endoplasmic reticulum bodies)是内质网衍生的结构，含有大量 PYK10黑芥子酶，该酶可以水解色氨酸(Trp)衍生的吲哚硫代葡萄糖苷(Indole glucosinolates, IGs)。IGs是一类在植物中广泛存在的次生代谢产物，通过植物根系释放 到土壤中。目前的研究表明，IGs分解产生的异硫氰酸盐具有抗菌活性，可以抑制土壤 中的病原微生物生长，从而减少植物的病害发生率。特定的IGs可以选择性地促进或抑 制某些微生物的生长，从而影响土壤微生物群落的组成和功能。此外，IGs还参与调控 植物的养分吸收、生长发育以及抵御逆境等等。考虑吲哚硫代葡萄糖苷在根-土壤相互 作用中发挥重要作用，但是根中的内质网体对于根-土壤界面与土壤微生物互作的影响 尚不明确。他们的研究表明内质网对调节根际微生物群很重要，部分是通过调控色氨 酸衍生的相关代谢物分泌到根际。首先，研究者使用内质网体突变体(nai1)、内质网体 内黑芥子酶突变体(pyk10bglu21)、吲哚硫代葡萄糖苷生物合成突变体(myb34/51/122) 和色氨酸特异代谢(cyp79b2b3)突变体，分析它们在自然土壤中的根微生物群落，评估 外源收集的根分泌物对土壤或合成微生物群落的影响，并在单关联设置中测试它们对 真菌内生菌的反应。结果表明，突变体在根际和内层的细菌和真菌群落均有不同。用 突变体的根分泌物处理的自然土壤和细菌合成群落表现出与野生型分泌物处理的不 同的微生物特征。并且大多数内生菌严重抑制cyp79b2b3的生长，部分抑制pyk10bglu21 的生长。该项研究结果表明，根内质网体及其包含的黑芥子酶调节根分泌代谢，从而 影响根与微生物群的相互作用。这一研究对寻求管理健康土壤的新解决方案具有重要 意义。
[前沿资讯 ] 布鲁克海文国家实验室解析木质素甲基转移酶对水稻的影响 进入全文
植物生物技术Pbj
美国布鲁克海文国家实验室刘长军团队此前通过蛋白质工程创制了一组新型木 质素单体4-O-甲基转移酶（MOMTs）。近日，他们评估了其中的两种酶，MOMT4和 MOMT9，对水稻木质纤维素特性的作用，深入研究了它们对水稻木质素的合成以及 对生长发育的影响、并探讨了其潜在应用价值。该研究为草本类木质纤维素品质的分 子改良提供了基因储备和材料基础。相关研究成果在线发表在植物学知名期刊Plant Biotechnology Journal上。禾本科植物如水稻的木质纤维素同双子叶植物相比具有更为 复杂的成分和结构。其木质素中除含有传统木质素单体外，还存在酰基化修饰的木质 素单体和类黄酮类物质。另外，这类木质纤维素还含有与细胞壁交联的羟基肉桂酰酯， 特别是阿魏酸酰酯。这些酚类化合物可交联细胞壁半纤维素中的阿拉伯木聚糖链，或 阿拉伯木聚糖链和木质素多聚体， 从而增加细胞壁结构的稳定性。但这些独特的分 子结构也增加了通过基因工程优化草本类木质纤维素的难度，进而限制了纤维素生物 质材料在工农业生产中的有效利用。因此开发新型的针对禾本科植物木质纤维素品质 改良的分子工具，对于高效利用农作物秸秆有重要的意义。刘长军团队此前通过蛋白 质工程创制了一组能修饰木质素单体的甲基转移酶即MOMTs， 其能有效并特异催化 木质素单体苯环对位羟基的甲基化修饰，从而调控木质素多聚体的合成。本研究中， 团队对MOMT4和MOMT9的体外酶活性进行了更为细致的分析，进一步证实了 MOMTs对木质素单体苯环对位羟基的特异修饰，以及这两类酶对木质素单体修饰的 偏好行性，即MOMT4对松柏醇和芥子醇单体有较强的活性，而MOMT9则对松柏醇单 体有明显的偏好，同时对阿魏酸也有较强的催化活性。有意思的是，MOMTs除作用 于木质素单体外对一系列其它酚类物质如类黄酮类物质也显示出一定的非特异活性。 这些特性使得MOMTs的表达可广泛影响水稻中酚类物质的合成代谢。
