本发明属于动物传染病防治技术领域,具体涉及一种乙型脑炎病毒的保护性单克隆抗体及其抗原位点的应用。制备得到一种由保藏编号为CCTCC NO:201699的JEV NS1杂交瘤细胞株2B8分泌的对乙型脑炎病毒NS1蛋白的保护性单克隆抗体。所述的单克隆抗体能识别NS1蛋白中的225位WPETHTLWGD234位的氨基酸片段,该片段的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示。本发明还公开了一种对乙型脑炎病毒NS1蛋白具有保护作用的多肽,该多肽的氨基酸序列为WPETHTLWGD。生物功能验证表明本发明的单克隆抗体可在制备治疗和预防乙型脑炎病毒疫苗中的应用。