本发明公开了乙型脑炎病毒E蛋白中和性B细胞抗原表位多肽,还公开了该抗原表位多肽在防治和诊断乙型脑炎病毒中的应用,属于分子免疫学领域。本发明所述的抗原表位多肽的氨基酸序列选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示的其中任意一种氨基酸序列。将本发明JEV E蛋白中和性B细胞抗原表位多肽作为免疫原或疫苗免疫动物机体后能够产生针对JEV的中和性抗体,并能够在体内或体外中和JEV,阻止病毒感染动物机体。本发明抗原表位多肽或其连接物能够作为检测乙型脑炎病毒抗体或抗乙型脑炎病毒多肽抗体的试剂。