本发明公开了稻瘟病抗性基因Pi64的2对功能性分子标记YRT3和YRT4及其方法与应用,通过比对和分析多个水稻品种中Pi64等位基因及其编码区上游序列,得到有别于感病等位基因以及其他稻瘟病抗性基因的Pi64功能特异性位点2处;通过设计引物,分别得到SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2,以及SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4;利用该引物扩增水稻总DNA,分别得到Pi64功能特异性分子标记YRT3和YRT4。本发明可在大量的水稻种质资源中筛选、鉴定该功能性抗性基因,以及在分子标记辅助选择育种、基因聚合育种以及转基因育种中的得到应用。