本发明公开了一种花生二酰甘油酰基转移酶AhDGAT3启动子(PAhDGAT3)的制备方法及其应用。该启动子如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。利用基因组步移方法克隆PAhDGAT3序列,应用SDS裂解法提取基因组DNA,在不同体系中分别用核酸内切酶酶切DNA,和接头片断连接后,以GSP1和AP1为引物进行第一轮PCR扩增,以GSP2和AP2为引物进行第二轮扩增,获得含有PAhDGAT3的DNA序列。该启动子具有驱动外源基因表达的功能,其表达部位在植物幼嫩种子的胚中,是一种组织特异性表达启动子,将其应用于转基因工程中可以驱动目的基因在幼嫩种子胚中表达积累,避免植物代谢过程中造成不必要的浪费,因此该启动子在植物转基因工程中具有良好的应用前景。