本发明公开了一种桑黄菌(火木层孔菌Phellinus igniarius(L ex Fr) Quel、裂蹄木层孔菌 phellinus linteus (Berk et Curt) Teng 、鲍氏层孔菌、哈蒂针层孔菌 Phellinus hartigii (Allesch et Schnabl) Imaz)中六氢-7-羟基-3 -(苯基甲基)吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮的分离方法。首先制备桑黄菌粗提物,然后进行正相硅胶层析,采用氯仿甲醇梯度洗脱,进行TLC检测,再次使用正相硅胶层析,然后是甲醇凝胶层析,经PLC检测后,进行反相硅胶层析,适当合并洗脱液,减压干燥,再次进行甲醇凝胶层析,经HPLC检测,既得六氢-7-羟基-3 -(苯基甲基)吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮。