本发明公开了一种桑黄菌(火木层孔菌Phellinus igniarius(L ex Fr)Quel、裂蹄木层孔菌phellinus linteus(Berk et Curt)Teng、鲍氏层孔菌、哈蒂针层孔菌Phellinus hartigii(Allesch et Schnabl)Imaz)(3R,8aS)-六氢-3-甲基吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮的分离方法。首先制备桑黄菌粗提物,然后进行正相硅胶层析,然后是甲醇梯度洗脱,再次正相硅胶层析,接下来是HPLC检测,然后进行常压反相制备,再次进行HPLC检测,最后1D-HNMR检测,即得(3R,8aS)-六氢-3-甲基吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮。