本发明公开了一种桑黄菌(火木层孔菌Phellinus igniarius(L ex Fr)Quel、裂蹄木层孔菌phellinus linteus(Berk et Curt)Teng、鲍氏层孔菌、哈蒂针层孔菌Phellinus hartigii(Allesch et Schnabl)Imaz)中反式-六氢-3-(1-苄基)吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮的分离方法。首先制备桑黄菌粗提物,然后进行正相硅胶层析,然后是甲醇梯度洗脱,再次进行正相硅胶层析,然后是反相制备,再次甲醇凝胶层析,然后HPLC检测最后是1D-HNMR检测,最终得到反式-六氢-3-(1-苄基)吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮。