本发明提供了一组具有胰蛋白酶抗性的抗菌肽及其制备办法。利用蛋白质定向改造技术,针对NZ2114序列中存在的六处胰蛋白酶活性位点进行有选择突变。设计氨基酸序列为SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:33的胰蛋白酶抗性突变体并实现其在毕赤酵母中的重组表达。本发明首次实现NZ2114抗胰蛋白酶衍生物的设计,经测定部分突变体(尤其是双突变体和全部三突变体)胰蛋白酶降解率显著改善,为16.67%-25%。胰蛋白酶抗性抗菌肽对金黄色葡萄球菌ATCC25923,ATCC43300和ATCC6538具有显著抑菌活性,MIC介于0.25-16μg/ml。本发明所述方法获得的胰蛋白酶抗性抗菌肽可应用于抗菌药物、食品添加剂、化妆品、饲料添加剂等领域,具有广阔的应用价值和市场前景。