本发明提供了一种烟草黑胫病0号和1号生理小种差异性肽段的鉴定方法,并按此方法鉴定出6个特有的肽段,其中,0号小种肽段具有SEQ ID NO:1‑3所示的氨基酸序列,1号小种肽段具有SEQ ID NO:4‑6所示的氨基酸序列。属于植物病原鉴定技术领域。该方法包括以下步骤:(1)提取烟草黑胫病菌的总蛋白;(2)以步骤(1)中得到的蛋白进行SDS‑聚丙烯酰胺凝胶电泳;(3)根据步骤(2)得到的电泳胶图挑选出差异条带;(4)将(3)获取的条带酶解,提取酶解肽段,进行LC‑MS分析;(5)对质谱结果采用Mascot2.2软件检索相应数据库,获得差异性蛋白肽段。