本发明公开了一种大泷六线鱼卵黄原蛋白夹心ELISA试剂盒、制备方法、检测方法及应用。本发明通过硫酸铵沉淀与Sephadex G‑200从17β‑雌二醇诱导的大泷六线鱼血浆中纯化出卵黄原蛋白,制备多克隆抗体,并将辣根过氧化物酶标记到纯化的抗体上;将大泷六线鱼卵黄原蛋白纯品、兔抗大泷六线鱼卵黄原蛋白多克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的兔抗大泷六线鱼卵黄原蛋白多克隆抗体、空白96孔酶标板、以及包被液、洗涤液、封闭液、样品稀释液、显色液、终止液各1支共同装入盒体,得到检测大泷六线鱼卵黄原蛋白的夹心ELISA试剂盒。本发明的试剂盒能够灵敏、准确的定量检测大泷六线鱼血浆、体表粘液、肝脏组织及肝细胞培养液中的卵黄原蛋白,检测范围为1.95~125 ng mL‑1,为我国近岸海域内分泌干扰物的检测提供了重要工具。