本发明公开了一种检测大泷六线鱼卵黄原蛋白的免疫印迹试剂盒及其制备方法、检测方法及应用。该试剂盒含有大泷六线鱼卵黄原蛋白纯品与兔抗大泷六线鱼卵黄原蛋白多克隆抗体。制备时,首先利用硫酸铵沉淀与Sephadex G‑200过滤层析从17β‑雌二醇诱导的大泷六线鱼血浆中纯化出卵黄原蛋白,然后免疫新西兰大白兔制备兔抗大泷六线鱼卵黄原蛋白多克隆抗血清,并利用Hitrap Protein G层析,纯化获得兔抗大泷六线鱼卵黄原蛋白多克隆抗体。本发明的试剂盒可以用于海洋环境雌激素类物质的筛选,能够灵敏、方便的定性检测大泷六线鱼血液、体表粘液、肝脏组织及肝细胞培养液中的卵黄原蛋白,最低检测限为50 ng mL‑1,为我国近岸海域内分泌干扰物的检测提供了重要工具。