本发明公开了一种检测大泷六线鱼卵黄原蛋白的间接ELISA试剂盒及其制备方法、检测方法和应用。制备时,首先利用硫酸铵沉淀与Sephadex G‑200层析从17β‑雌二醇诱导的大泷六线鱼血浆中纯化出卵黄原蛋白;然后,免疫大白兔制备其多克隆抗血清,利用Hitrap Protein G纯化获得多克隆抗体。将大泷六线鱼卵黄原蛋白纯品、兔抗卵黄原蛋白多克隆抗体、空白96孔酶标板1块、以及包被液、洗涤液、封闭液、样品稀释液、显色液、终止液和辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗各1支共同装入盒体,得到检测大泷六线鱼卵黄原蛋白的间接ELISA试剂盒。本发明的试剂盒能够灵敏、准确的定量检测大泷六线鱼血浆、体表粘液、肝脏组织及肝细胞培养液中的卵黄原蛋白,检测范围为15.625~1000 ng mL‑1,为我国近岸海域内分泌干扰物的检测提供了重要工具。