本发明涉及一种TPL2基因敲除的HEK293T细胞系及其构建方法和应用。本发明提供TPL2基因敲除HEK293T细胞系的构建方法,将人TPL2基因的第二外显子区域作为靶序列,具体的,将SEQ ID NO:1的TPL2等位基因1和等位基因2第二外显子的第390~459bp序列或第391~448bp序列作为靶序列。本发明提供TPL2基因敲除HEK293T细胞系HEK293T‑KO‑TPL2,其保藏编号为CCTCC NO:C2019328。本发明获得的敲除细胞系形态、增殖速度等方面均与对照细胞无明显差异,是较为理想的TPL2敲除细胞模型;改造后细胞系稳定,为探究TPL2蛋白抑制病毒复制的方式及病毒致病机理提供关键的生物材料,也可用于分离和培养SVA以及在SVA疫苗株的大规模细胞化培养和生产中进行应用。