本发明提供了一种O型口蹄疫耐酸疫苗毒株及其构建方法,属于兽药生物制品技术领域。所述O型口蹄疫耐酸疫苗毒株rD86H,包括病毒结构蛋白VP2第86位天冬氨酸(D)突变为组氨酸(H)。所述耐酸毒株rD86H的结构蛋白VP2D86H具有如序列表中SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。本发明通过突变结构蛋白VP2中第86位D为H,从而使O型口蹄疫疫苗毒株具有极高的酸稳定性。所述毒株在提高酸稳定性的同时,还提高了所述毒株的热稳定性,而且VP2第86位氨基酸的变化对亲本毒株的免疫原性、生长特性和复制能力几乎没有影响,因此本发明构建的耐酸突变株可作为优质疫苗种毒,提升FMDV灭活疫苗的免疫效力。