本发明公开了一种烟草尼古丁含量调控基因TIFY6B及其克隆方法与应用;所述的烟草尼古丁含量调控基因TIFY6B核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示;编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示;克隆方法包括烟草叶片cDNA合成:提取烟草叶片总RNA,反转录得到第一链cDNA;TIF6B基因的PCR扩增:以烟草叶片cDNA为模板,根据TIFY6B基因序列设计引物,进行PCR扩增,回收和纯化PCR扩增产物,并测序。应用为所述的烟草尼古丁含量调控基因TIFY6B在获得高尼古丁含量的转基因烟草植株中的应用。本发明在烟草植株内抑制TIFY6B基因的表达,可以明显提高烟叶中尼古丁的含量,在实际生产中拥有广阔的应用前景。