本发明涉及用于检测手足口病肠道病毒蛋白的单克隆抗体,以及采用该特异性单克隆抗体制备的ELISA检测试剂盒。本发明所述的抗手足口病肠道病毒蛋白的单克隆抗体是由保藏号为CCTCC NO:C2013161的杂交瘤细胞株HEV71‑vP1‑4G12产生,能特异性识别HEV71‑VP1蛋白中的序列号为SEQ ID NO:1的氨基酸序列。本发明所述的用于检测手足口病肠道病毒蛋白的ELISA检测试剂盒,包含ELISA酶标板、捕获抗体、包被抗原、酶标二抗、链亲和素‑辣根过氧化物酶、显色液、稀释液、终止液,其中,所述捕获抗体为如本发明所述的单克隆抗体,所述包被抗体为抗HEV71‑VP1多克隆抗体。该试剂盒对于手足口病肠道病毒蛋白提供了快速、特异、敏感的检测方法。