本发明提供用于检测抗猪产肠毒素性大肠杆菌抗体的融合蛋白、制备方法及应用,属于生物技术领域。所述融合蛋白,其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。制备融合蛋白的方法,包括:将所述融合蛋白的编码基因插入pCold I质粒,得到重组载体;将所述重组载体转化宿主细胞,获得阳性重组菌;诱导所述阳性重组菌表达融合蛋白,纯化后得到所述融合蛋白。本发明融合蛋白,免疫反应性良好,产量较高,可以用于同时检测抗F4和F5型猪产肠毒素性大肠杆菌抗体。本发明试剂盒方面,检测准确、操作简便,特异性、敏感性、重复性均良好,适合于在临床应用中进行推广,为抗ETEC抗体的快速检测提供了可靠手段。