本发明公开了一种猪凝血酶冻干粉的制备方法,包括以下步骤:抗凝猪血浆与凝胶混合搅拌吸附,过柱洗脱获得凝血酶原溶液;向兔脑粉中加入生理盐水,再加入凝血酶原溶液和CaCl2进行酶原激活,得凝血酶粗酶液,超滤脱盐并浓缩,进行病毒灭活,所得粗酶液过DEAE-Sepharose Fast Flow层析柱,洗脱收集目的峰,即得猪凝血酶;猪凝血酶加入甘露醇或右旋糖酐40,过滤除菌,分装,冻干,真空压塞,轧铝塑组合盖后,得猪凝血酶冻干品;冻干品在100℃下进行干热处理以再次灭活病毒,包装即得猪凝血酶冻干粉。产品中猪凝血酶比活性不低于130U/mg,整个工艺步骤简单、易实施,提高了制品安全性,适合于工业化生产。