The present invention provides a chromatographic separation process for recovering a polyunsaturated fatty acid (PUFA) product from a feed mixture, which comprises: • (a) purifying the feed mixture in a first chromatographic separation step using as eluent a mixture of water and a first organic solvent, to obtain an intermediate product； and • (b) purifying the intermediate product in a second chromatographic separation step using as eluent a mixture of water and a second organic solvent, to obtain the PUFA product, wherein the second organic solvent is different from the first organic solvent and has a polarity index which differs from the polarity index of the first organic solvent by between 0.1 and 2.0, wherein the PUFA product is other than alpha-linolenic acid (ALA), gamma-linolenic acid (GLA), linoleic acid, an ALA mono- di- or triglyceride, a GLA mono- di- or triglyceride, a linoleic acid mono, di- or triglyceride, an ALA C1 -C4 alkyl ester, a GLA C1 -C4 alkyl ester or a linoleic acid C1 -C4 or a mixture thereof.Cette invention concerne un procédé de séparation chromatographique qui permet de récupérer un produit d'acide gras polyinsaturé (PUFA) à partir d'un mélange d'alimentation, ledit procédé comprenant : (a) la purification du mélange d'alimentation dans une première étape de séparation chromatographique utilisant à titre d'éluant un mélange d'eau et d'un premier solvant organique, pour obtenir un produit intermédiaire； et (b) la purification du produit intermédiaire dans une seconde étape de séparation chromatographique utilisant à titre d'éluant un mélange d'eau et d'un second solvant organique, pour obtenir le produit PUFA. Le second solvant organique est différent du premier et a un indice de polarité qui diffère de celui du premier solvant organique d'une valeur comprise entre 0,1 et 2,0, le produit PUFA étant autre qu'un acide alpha-linolénique (ALA), un acide gamma-linolénique (GLA), un acide linoléique, un mono-, un di- ou un triglycéride ALA, u
