The present invention provides a chromatographic separation process for recovering polyunsaturated fatty acid (PUFA) products from a feed mixture comprising: (a) using a mixture of water and a first organic solvent as the eluent to obtain an intermediate product Thereby purifying the feed mixture in a first chromatographic separation step； And (b) purifying said intermediate product in a second chromatographic separation step, using a mixture of water and a second organic solvent as eluent, to obtain a PUFA product, wherein said second organic solvent is 1 organic solvent and has a polarity index of the first organic solvent and a polarity index different by between 0.1 and 2.0 wherein the PUFA product is selected from the group consisting of alpha-linolenic acid (ALA), gamma-linolenic acid (GLA), linoleic acid, Di- or triglycerides, GLA mono-, di- or triglycerides, linoleic acid mono-, di- or triglycerides, ALA C 1 -C 4 alkyl esters, GLA C 1 -C 4 alkyl esters or linoleic acid C 1 -C 4 alkyl ester or a mixture thereof.본 발명은 공급 혼합물로부터 고도불포화 지방산 (PUFA) 생산물을 회수하기 위한 크로마토그래피 분리 공정을 제공하며, 상기 공정은: (a) 중간 생산물을 얻기 위해, 용리액으로서 물 및 제1 유기 용매의 혼합물을 사용하여 제1 크로마토그래피 분리 단계에서 상기 공급 혼합물을 정제하는 단계； 및 (b) PUFA 생산물을 얻기 위해, 용리액으로서 물 및 제2 유기 용매의 혼합물을 사용하여 제2 크로마토그래피 분리 단계에서 상기 중간 생산물을 정제하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 제2 유기 용매는 상기 제1 유기 용매와 다르고, 제1 유기 용매의 극성 지수와 0.1 및 2.0 사이만큼 다른 극성 지수를 가지며, 여기서, 상기 PUFA 생산물은 알파-리놀렌산 (ALA), 감마-리놀렌산 (GLA), 리놀레산, ALA 모노-, 디- 또는 트리글리세라이드, GLA 모노-, 디- 또는 트리글리세라이드, 리놀레산 모노-, 디- 또는 트리글리세라이드, ALA C1-C4 알킬 에스테르, GLA C1-C4 알킬 에스테르 또는 리놀레산 C1-C4 알킬 에스테르 또는 이의 혼합물이 아니다.
