本发明公开了一种酪蛋白来源的降胆固醇肽及其制备方法和应用,所述降胆固醇肽包含下述的氨基酸序列:SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。该肽通过蛋白酶水解酪蛋白获得酶解液,酶解液经超滤、层析分离、超高效液相质谱联用分析得到多肽序列,合成多肽验证降胆固醇活性后获得。本发明所述的酪蛋白来源的降胆固醇肽来源于牛乳;本发明所述方法的凝胶过滤层析获得的降胆固醇粗肽无需进行液相色谱分离,直接采用超高效液相质谱联用UPLC‑MS分析降胆固醇肽的氨基酸序列,并且合成降胆固醇肽进一步验证降胆固醇活性,确定降胆固醇肽序列,提高了效率;本发明所述酪蛋白来源的降胆固醇肽能够用于制备功能性食品,从而抑制外源胆固醇的吸收。