本发明公开了斑马鱼防御素defbl3的优化基因,其重组蛋白的制备方法。本发明还提供了包含该优化基因的重组表达载体和酵母宿主细胞,该优化基因在生产斑马鱼防御素defbl3中的应用,和该重组蛋白在制备抗菌药物中的应用。本发明在不改变斑马鱼防御素defbl3氨基酸序列的前提下,按照毕赤酵母偏爱密码子对斑马鱼防御素defbl3基因的核苷酸序列进行了优化,优化后的序列为SEQ ID NO:2。本发明通过在毕赤酵母宿主细胞中表达该优化基因,制备了重组斑马鱼防御素defbl3。该制备方法可高效地制备防御素defbl3,所用培养条件简单,成本较低,得到的防御素defbl3抗菌效果好。