Provided are a matrix scaffold for three-dimensional cell culturing and construction method and use thereof. The matrix scaffold is prepared by performing a cross-linking reaction of a silk fibroin substance prepared from a cocoon shell or silk via a particular method and chitosan and a crosslinking agent. The matrix scaffold substitutes for an extracellular matrix or a matrix of a tissue or an organ, being further used for cell differentiation and proliferation in vitro, tissue and organ reconstruction, and tumor drug screening.Linvention concerne un échafaudage matriciel pour culture cellulaire en trois dimensions et le procédé de construction et lutilisation de celui-ci. Léchafaudage matriciel est préparé en effectuant une réaction de réticulation dune substance de fibroïne de soie préparée à partir dune coque de cocon ou de soie par lintermédiaire dun procédé particulier et de chitosane et dun agent de réticulation. Léchafaudage matriciel remplace une matrice extracellulaire ou une matrice dun tissu ou dun organe, étant en outre utilisé pour la différenciation cellulaire et la prolifération in vitro, la reconstruction de tissu et dorgane, et le criblage de médicaments antitumoraux.