本发明公开了一种用于检测大豆脂肪酸脱氢酶合成基因A3型突变的引物组及应用,属于植物分子标记开发和作物分子辅助选择技术领域。本发明所提供的引物组的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.4所示。本发明还提供了利用引物进行A3突变型检测的方法,该方法是以待测样品的DNA为模板,以如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.2所述序列为引物进行第一轮PCR扩增,稀释扩增产物后,再以稀释后的扩增产物为模板,以如SEQ ID NO.3-SEQ ID NO.4所述序列为引物进行第二轮PCR扩增,最后利用高分辨率熔解曲线分析仪器对第二轮扩增产物进行基因型突变检测。本发明可以大大缩短高油酸大豆材料的筛选周期,为高油酸大豆品种的培育提供了分子标记资源。