本发明公开了一种聚乙二醇-rTRAIL突变体三聚体-海兔毒素偶联物及其制备方法和应用。一种聚乙二醇-rTRAIL突变体三聚体-海兔毒素偶联物,rTRAIL突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示,rTRAIL突变体三聚体上偶联有单甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺以及带连接臂的海兔毒素。本发明偶联物比rTRAIL突变体三聚体-海兔毒素偶联物具有更强的肿瘤细胞杀伤能力,比rTRAIL突变体-单甲基化聚乙二醇马来酰亚胺偶联物具有更长的半衰期;表明在本发明偶联物中,单甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺、rTRAIL突变体三聚体、海兔毒素并非是单独发挥各自作用的,三者之间产生了较强的协同作用。