本发明公开了一种青霉素G酰化酶突变体及其编码基因和应用,所述青霉素G酰化酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示,所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明还提供了所述的青霉素G酰化酶突变体在合成头孢类抗生素中的应用。本发明提供了一种新的青霉素G酰化酶突变体,与野生型相比,青霉素G酰化酶突变体在合成头孢类抗生素如头孢丙烯、头孢克洛或头孢羟氨苄时具有更高的活性,尤其是在催化7-APRA与侧链2-羟基乙基对羟基苯甘氨酸酯合成头孢丙烯时,酶活力极大提高,比活力由原先1.5U/mg提升到35U/mg,且合成水解活力比没有下降,合成水解比可达1.8。