本发明公开了一种大籽猕猴桃EST‑SSR分子标记及其应用,大籽猕猴桃EST‑SSR分子标记是3个具有多态性的EST‑SSR分子标记AM‑es03、AM‑es06和AM‑es09,其序列如SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.6所示。本发明以8个大籽猕猴桃群体及3个同属亲缘关系较近猕猴桃属植物基因组DNA模板为研究对象,根据转录组序列信息,选择其中以三碱基为重复基元的SSR位点,采用Primer 5.0设计EST‑SSR引物。经过PCR扩增、聚丙烯酰胺凝胶电泳、克隆验证、STR基因分型筛选出3个具有多态性的EST‑SSR分子标记,能够有效、快速地鉴别猫人参药材的基源植物大籽猕猴桃与其近源种。这些分子标记可用于大籽猕猴桃的种质鉴定及评价,以及研究种群的遗传多样性。