The present invention relates to a method of preparing at least one rhamnolipid comprising: contacting a recombinant cell with a medium containing a carbon source； and culturing the cell under suitable conditions for preparation of the rhamnolipid from the carbon source by the cell, wherein the recombinant cell has been genetically modified such that, compared to the wild-type of the cell, the cell has an increased activity of at least one of the enzymes E1, E2 and E3, wherein the enzyme E1 is an α/β hydrolase, the enzyme E2 is a rhamnosyltransferase I and the enzyme E3 is a rhamnosyl-transferase II, and wherein the carbon source is a C4 molecule.La présente invention concerne un procédé de préparation d'au moins un rhamnolipide comprenant les étapes suivantes : mise en contact d'une cellule recombinée avec un milieu contenant une source de carbone ； et culture de la cellule dans des conditions appropriées pour la préparation du rhamnolipide à partir de la source de carbone par la cellule, la cellule recombinée ayant été génétiquement modifiée de sorte que, comparée à une cellule sauvage, la cellule présente une activité accrue d'au moins une des enzymes E1, E2 et E3, l'enzyme E1 étant une α/β-hydrolase, l'enzyme E2 étant une rhamnosyltransférase I et l'enzyme E3 étant une rhamnosyltransférase II, et la source de carbone étant une molécule en C4.
