本发明涉及尼罗罗非鱼淋巴细胞抗原75(OnLy75)的克隆、原核表达和抗罗非鱼OnLy75多克隆抗体制备的方法。公开了OnLy75基因全长序列,该序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。所述OnLy75的编码序列位于SEQ ID NO.1的5’端第88~5286位脱氧核苷酸,编码1732个氨基酸,氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。公开了用于制备OnLy75多克隆抗体的多肽序列,具体为序列表SEQ ID NO.4所示的序列,以及用于制备所述多克隆抗体的组合物。公开了制备抗罗非鱼OnLy75多克隆抗体的方法、由该方法获得的兔多克隆抗体及其在Western Blot检测中的应用。