本发明“黄瓜果实苦味基因Bt紧密连锁的SSR标记及其应用”,涉及生物育种辅助技术。标记序列如下:SSR21558-F/SSR21558-R:GTGGGGGATGTGATTCAGAC/CATCATCCATTCCCCTCAAC,其扩增的特征条带如Seq ID No.1所示(175bp)和Seq ID No.2所示(192bp)。SSR20054-F/SSR20054-R:GTTTGTGAGGGAAACGCAAT/TCAAAAAGCTTCCTTCCTTCA,其扩增的特征条带如Seq ID No.3所示(127bp)和Seq ID No.4所示(108bp)。本发明的两个标记与Bt基因的连锁更加紧密,对于黄瓜果实苦味的分子标记辅助育种体系的建立更有帮助;采用本发明获得的SSR标记,可以在黄瓜候选材料的任何阶段对其进行果实苦味或果实无苦味的筛选,具有高效、限制少、准确的优点,为黄瓜育种选择无苦味材料提高了选择效率和准确性。