本发明公开了一种同时检测对虾IMNV、YHV和TSV的多重PCR检测引物及试剂盒。所述引物分别为IMNV-F和IMNV-R、YHV-F和YHV-R、TSV-F和TSV-R,序列如SEQ ID NO:1和2,SEQ ID NO:3和4,SEQ ID NO:5和6所示。本发明的引物彼此间无交叉,且不与其它病毒产生交叉,假阳性率低,能够特异性的检测出分布于世界各地不同地区的3种病毒的病毒株,具有广泛适用性,具有非常高的特异性和敏感性,检测限低。同时对检测的病毒基因片段无需再进行克隆、测序和序列比对。一次实验即可检测出待测样品中是否含有这三种病毒中的一种、两种或三种。