本发明提供用于同时检测鳗鲡疱疹病毒EHV、日本鳗鲡表皮细胞坏死病毒JEECV和花鳗鲡多瘤病毒AmPV的多重PCR引物组、试剂盒及检测方法,本发明根据获得的核酸序列,设计用于扩增EHV,JEECV和AmPV的特异性引物,避免引物之间形成稳定的引物二聚体,并对引物扩增序列的特异性进行分析,获得由6条核酸序列组成,可同时对EHV,JEECV和AmPV具有高的扩增灵敏性和特异性的引物组,包括:SEQ ID NO:1‑6。本发明可在同一PCR反应体系中同时检测和鉴别EHV,JEECV和AmPV,具有操作简便,特异性强等优点;而且本发明可根据扩增长度的不同直接判定结果,更高效、实用。