本发明涉及一种新城疫嵌合病毒标记疫苗株及其构建方法和应用,属于新城疫嵌合疫苗株的拯救及应用领域。本发明利用新城疫病毒反向遗传操作平台,将新城疫基因GⅦ型毒株的F蛋白裂解位点突变为弱毒株的裂解位点,该突变后的基因VII型新城疫毒株的F和HN基因与基因II型NDV La Sota株的NP、P、M、L构建全长嵌合cDNA序列,并在P和M之间的非编码区插入18bp的核苷酸标记序列。转染细胞拯救获得了新城疫嵌合病毒NDV DC株。本发明构建的嵌合病毒在鸡胚和细胞中均能达到较高的培养滴度。嵌合后的毒株含有基因VII型新城疫毒株的囊膜表面糖蛋白,并含有基因II型毒株的骨架,兼具新城疫基因VII型毒株的免疫原性和基因II型La Sota株的高繁殖和高安全特性。