本发明公开了一种水稻EPSP合成酶突变基因、突变体及其应用。该水稻EPSP合成酶突变基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明通过人工突变技术将野生型水稻EPSP合成酶基因中编码第102位氨基酸、第106位氨基酸和第381位氨基酸的密码子进行突变得到,使得第102位氨基酸残基由苏氨酸突变成异亮氨酸、第106位氨基酸残基由脯氨酸突变成丝氨酸、第381位氨基酸残基由脯氨酸突变成亮氨酸,得到水稻EPSP合成酶突变基因;将水稻EPSP合成酶突变基因转入受体后获得的转基因作物具有较好的草甘膦抗性,对筛选和培育抗草甘膦作物新品种具有重要意义。