本发明公开了一种抗MSLN单克隆内化抗体及其制备方法和应用,所述抗体包括重链可变区和轻链可变区,所述重链可变区包含如SEQ ID NO:1所示的重链可变区CDR1;如SEQ ID NO:3所示的重链可变区CDR2;如SEQ ID NO:5所示的重链可变区CDR3;所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:7所示的轻链可变区CDR1;如SEQ ID NO:9所示的轻链可变区CDR2;和如SEQ ID NO:11所示的轻链可变区CDR3。本发明的抗体特异性好,亲合力较高,可结合细胞表面表达,并可被细胞高效转运至胞内,携带毒素分子同步进入细胞从而将细胞杀死,该抗体可广泛应用在肿瘤免疫治疗的药物中。