本发明公开一种用于鉴定黄瓜黑斑病抗性的引物序列及其鉴定方法，引物序列是由序列表中SEQ ID No1、SEQ ID No2所述的核苷酸序列组成；鉴定黄瓜黑斑病抗性的方法，步骤是(1)提取黄瓜基因组DNA；(2)用序列表中SEQ ID No1、SEQ ID No2所述的核苷酸序列为引物进行PCR扩增；(3)扩增产物的凝胶电泳分析；(4)依据各被鉴定样品在凝胶上条带的相对位置，鉴定黄瓜黑斑病的抗性。利用本发明的引物序列对构建的F2代分离群体和黄瓜种质资源进行黑斑病抗性评价，其结果与人工接种鉴定符合率分别达95.04％和94.74％，与抗黑斑病基因的连锁遗传距离为4.96cM，而且具有快速、准确、不受环境条件影响等优点，在黄瓜育种中进行资源抗性筛选具有很大的应用价值。
