本发明公开了转基因苜蓿草J163品系特异性环介导等温扩增检测用引物及检测方法和应用。所述引物的序列分别如SEQ ID NO.1~SEQ ID NO.6所示。本发明针对我国农业部未颁发农业转基因生物安全证书的美国孟山都公司转基因苜蓿草品系J163,在转基因苜蓿草J163品系的5’端外源插入片段P-eFMV(启动子)与苜蓿草基因组DNA之间的邻接区设计一组特异性引物,以BstDNA聚合酶启动环介导等温扩增,成功建立了苜蓿草J163品系特异性环介导等温扩增(LAMP)快速检测方法,操作简单,特异性强,灵敏度高,检测最低拷贝数为10,能够快速、准确地对转基因苜蓿草J163成分进行检测分析和鉴定。