本发明公开了一种用于鉴定烤烟龙江981的引物组合及试剂盒、应用及鉴定方法,属于生物分子鉴别技术领域。本发明利用烟草420K高密度SNP芯片对近年来我国烟草主栽品种进行全基因组SNP分型,根据品种间多态性SNP位点筛选获得一套适用于鉴定烤烟龙江981的特异性SNP标记共10个,其物理位置基于栽培烟草品种红花大金元的全基因组序列比对确定,包含SNP位点的基因序列如SEQ ID NO:1~10所示。针对烤烟龙江981的SNP位点侧翼序列,根据检测方法的不同设计相应引物,可用于烤烟龙江981的品种鉴定。本发明基于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术建立的烤烟龙江981品种鉴定方法,检测周期短、通量高。