本发明涉及用于鉴定烤烟毕纳1号的引物组合及试剂盒、应用及检测方法,属于烟草品种鉴定技术领域。本发明利用烟草420K高密度SNP芯片对近年来我国烟草主栽品种进行全基因组SNP分型,根据品种间多态性SNP位点筛选获得了一套适用于鉴定烤烟毕纳1号的特异性SNP标记共15个,并对比栽培烟草参考基因组获得的15个SNP位点侧翼序列,其序列如SEQ ID NO:1~15所示,基于该序列设计引物;利用设计的引物,采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术对这些位点进行分型检测。根据检测结果获得SNP分型结果,鉴定样品是否为毕纳1号,本发明的检测方法检测时所需检测样品量少,检测通量高,鉴定结果准确。