本发明公开了抗CTLA‑4的纳米抗体Nb16及其制备方法与应用。本发明所提供的纳米抗体,包含决定簇互补区和框架区;所述纳米抗体的决定簇互补区由CDR1、CDR2和CDR3组成;所述CDR1的氨基酸序列为序列表中SEQ ID No.1的第26‑35位氨基酸;所述CDR2的氨基酸序列为序列表中SEQ ID No.1的第51‑59位氨基酸;所述CDR3的氨基酸序列为序列表中SEQ ID No.1的第97‑106位氨基酸。本发明的纳米抗体Nb16可以与T细胞及CTLA‑4结合,可应用于CTLA‑4分子检测试剂的研发,制备肿瘤抑制剂或肿瘤细胞抑制剂以及制备抑制CTLA‑4活性和促进T细胞增殖的药物。