本发明公开了一种新的α-半乳糖苷酶基因、其编码蛋白及其制备方法和用途。本发明首先从青霉(Penicillium sp.)F63(CGMCC No.1669)中分离纯化出α-半乳糖苷酶,再分离、克隆得到编码该酶的基因(SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列)。此外,本发明还公开了制备该α-半乳糖苷酶的方法,包括:构建含有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的重组表达质粒;培养用该重组表达质粒所转化的宿主细胞,得重组菌株;培养该重组菌株,诱导重组α-半乳糖苷酶的表达,回收并纯化所表达的α-半乳糖苷酶。通过核苷酸和氨基酸序列比较,该α-半乳糖苷酶为一新的α-半乳糖苷酶。试验证实,本发明α-半乳糖苷酶能够较好的水解大豆中棉子糖和水苏糖,可应用于饲料和食品工业。